姜嵐 龐金環(huán) 肖偉烈 張國麗 劉俊 楊超

（1. 中國科學院微生物研究所，北京 100101；2. 云南大學教育部和云南省自然資源藥物化學重點實驗室，昆明 650091；3. 新疆農(nóng)墾科學院，石河子 832000）

由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）引起的棉花黃萎病是我國棉花生產(chǎn)上的重要病害，嚴重影響棉花的產(chǎn)量，成為棉花可持續(xù)生產(chǎn)的主要障礙之一［1］。棉花黃萎病是一種土傳性的維管束真菌病害，防治難度較大。選育和種植抗性品種是目前防治棉花黃萎病的主要措施，但是存在選育周期長及抗性不穩(wěn)定的缺點。市場上也存在抗棉花黃萎病的農(nóng)藥或混配殺菌劑，雖然可以在一定程度上有效防治棉花黃萎病，但是化學農(nóng)藥的大量使用會污染環(huán)境并危害人類健康。此外，化學農(nóng)藥的使用也會增強病菌的抗藥性，并對田間其它有益微生物產(chǎn)生抑制作用［2］。為緩解農(nóng)藥殘留帶來的環(huán)境污染，滿足無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的需要，生物農(nóng)藥的研究與開發(fā)已成為我國病蟲害防治研究的熱點之一［3］。目前國內(nèi)已有少量利用中藥或植物提取物來防治棉花黃萎病的報道［4-6］，主要集中在抑制菌絲生長、毒素分泌、孢子萌發(fā)和孢子產(chǎn)量等方面的研究。

本研究采用56種中藥提取物，通過生長速率測定、莖稈切片觀察及防治效果分析，初步確定部分中藥提取物既可直接有效抑制大麗輪枝菌菌絲生長又能提高棉花黃萎病的防治效果，旨為進一步研發(fā)防治棉花黃萎病的新型生物農(nóng)藥提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試中藥提取物 供試中藥材來自于云南省藥材公司，藥材品名和對應植物部位均為《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定藥材。取樣0.5-1.0 kg藥材，按藥材特性和比重，用1-2 L的玻璃層析柱進行分離。洗脫溶劑體積為柱床體積的3倍，并將溶劑提取段按餾分順序分為前段、中段和后段，各為1倍柱床體積。洗脫液經(jīng)旋轉蒸發(fā)器濃縮待用。

1.1.2 植物病原菌及植物材料 棉花黃萎病病原菌（大麗輪枝菌）為新疆農(nóng)墾科學院分子農(nóng)業(yè)技術育種中心鑒定的132T菌株。供試棉花品種為TM-1。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物抑菌活性測定 采用生長速率法測定中藥提取物對菌絲的生長抑制作用。將56種中藥提取物用甲醇的水溶液溶解或懸浮成懸濁液，按比例加至PDA平板，使其終濃度分別為 1 g/L、10 g/L和20 g/L 3個梯度的質(zhì)量濃度。以添加水或等量百分比的甲醇水溶液的PDA培養(yǎng)基平板為對照。

將液態(tài)培養(yǎng)的大麗輪枝菌過濾并離心收集孢子，制成濃度為1×107個/mL的孢子懸浮液。吸取5 μL孢子溶液接種于PDA培養(yǎng)基中央，于28℃暗培養(yǎng)7 d。每個處理重復2次。采用十字交叉法測定菌落直徑，并計算抑菌率。

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100。

1.2.2 中藥提取物對棉花黃萎病防治效果調(diào)查 中藥提取物用DMSO溶解，再用0.1%的吐溫-80℃溶液稀釋到3 g/L質(zhì)量濃度。選取二葉一心期棉苗12株，將3 g/L的中藥提取物溶液噴霧到棉苗葉片表面，至葉面全部噴濕。葉面噴施5 mmol/L水楊酸作為陽性對照［7］，噴施含DMSO的0.1% 土溫-80作為陰性對照。中藥提取物噴施后第3天進行棉苗蘸根接菌，孢子懸浮液濃度為5×106個/mL。接菌2周后進行病情指數(shù)統(tǒng)計及防治效果分析。上述實驗重復3次。發(fā)病程度劃分為六級：1級（級值為0）：植株健康，葉片無發(fā)病癥狀；2級（級值為1）：子葉發(fā)病或脫落；3級（級值為2）：1片真葉發(fā)病或脫落；4級（級值為3）：2片真葉發(fā)病或脫落；5級（級值為4）：3片真葉發(fā)病或脫落；6級（級值為5）：4片以上真葉發(fā)病或脫落以及整株萎蔫或頂心枯死。計算公式分別為：

病情指數(shù)＝∑（各級植株數(shù)×對應級值）/（植株總數(shù)×最高級值）；

防治效果＝［（負對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/負對照病情指數(shù)］×100%。

2 結果

2.1 中藥提取物對大麗輪枝菌的抑制活性篩選

采用生長速率法，對56種提取物在質(zhì)量濃度分別為1、10 和20 g/L下進行抑菌作用測定。如表1所示，在1 g/L濃度下抑菌率達到50%的中藥提取物有3種，分別為紅花木蓮氯仿段（50%，4號），華蓋木石油醚部分（57.1%，42號）和黃苞大戟正丁醇部位（53.6%，46號）。在10 g/L濃度下抑菌率達到50%以上的有26種，其中5種提取物的抑菌率達到了100%，分別為24、45、46、47和56號。在20 g/L濃度下抑菌率達到100%的提取物有18種，主要集中于五味子、鐵箍散、華蓋木、黃苞大戟、中平樹、大果大戟、尾葉血桐、栽秧花和盾葉木等植物提取物中。其中以五味子最為突出，鐵箍散和黃苞大戟次之。

表1 56種中藥提取物對大麗輪枝菌菌絲的生長抑制作用

續(xù)表

2.2 中藥提取物對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用

測定抑菌率時發(fā)現(xiàn)，在不同提取物不同濃度下，PDA培養(yǎng)基上大麗輪枝菌的菌絲生長均受到不同程度的影響（圖1），可歸納為以下5種類型：（1）在1 g/L濃度下已經(jīng)能夠明顯抑制菌生長，但隨著濃度的提高抑菌活性變化并不大（如4號）；（2）在1 g/L濃度下抑菌作用明顯，但在10 g/L濃度下抑菌率達到100%（如46號）；（3）在1 g/L濃度下抑菌作用較弱，但在10 g/L濃度下抑菌率達到100%（如24號）；（4）濃度增加到20 g/L時表現(xiàn)出良好的抑菌效果（如7號、37號、49號、51號和54號）；（5）在所有濃度下都沒有明顯抑菌效果，菌絲生長正常（如48號）。

圖1 代表性中藥提取物對大麗輪枝菌的抑制活性篩選

2.3 中藥提取物對棉花黃萎病的防治效果鑒定

從2.2中分類的5種類型中，隨機選取了13種中藥提取物對其防治效果進行進一步鑒定。用3 g/L中藥提取物處理棉花植株，統(tǒng)計棉花黃萎病病情指數(shù)。由于不同批次實驗條件的差異，病情指數(shù)不能直接用于比較，因此以每一批次的陰性對照病情指數(shù)為基準計算防治效果進行比較評價。實驗中發(fā)現(xiàn)部分中藥提取物對棉花本身存在一定的毒害作用，處理后植株表現(xiàn)出非病態(tài)的傷害表型，因此對其結果不做統(tǒng)計。如表2所示，在3 g/L的中藥提取物濃度下，2號、3號、12號和13號提取物防治效果較好且重復性良好，表明這些提取物對棉花黃萎病有明顯的防治效果。而其它提取物的防治效果較差（有的甚至為負值）或重復性差，說明這些提取物雖然抑菌活性強，但對黃萎病的防治效果并不明顯。而黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段（13號）提取物的抑菌率在10 g/L和20 g/L濃度下分別為71.4%和100%，明顯高于黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=10∶1段（16號）和紅花木蓮氯仿∶丙酮=40∶1段（3號）提取物（表1）。這說明黑龍江產(chǎn)五味子的氯仿∶丙酮=3∶2段提取物不僅可以有效地抑制大麗輪枝菌的菌絲生長，而且可以提高棉花黃萎病的防治效果。

2.4 黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物對棉花黃萎病的抑制作用

為進一步揭示黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物對棉花黃萎病的抑制作用，采用質(zhì)量濃度為3 g/L的提取物處理二葉一心期棉花幼苗，并在接菌后2周進行棉花莖稈切片觀察。如圖2-A所示，在對照植株中，大麗輪枝菌侵染導致明顯的維管束褐化。而在提取物處理的植株莖稈中，由病原菌引起的棉花維管束褐變程度得到有效緩解。觀察整體植株發(fā)現(xiàn)，提取物處理可以明顯緩解黃萎病引起的落葉癥狀（圖2-B）。以上結果表明，黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物可能通過抑制病菌侵染維管束來提高棉花對于黃萎病的抗性作用。

表2 中藥提取物對黃萎病的防治效果測定

3 討論

3.1 中藥提取物對大麗輪枝菌的菌絲生長有強烈的抑制作用

已有報道稱部分中藥提取物可以有效抑制大麗輪枝菌的菌絲生長，并且對馬鈴薯晚疫病、果蔬致腐真菌、芒果炭疽菌和蒂腐菌等具有較好的抑制效果［8-10］。本實驗中發(fā)現(xiàn)26種中藥提取物對大麗輪枝菌有不同程度的抑制效果，其中五味子氯仿∶丙酮的不同比例提取段均具有良好的抑菌效果，在質(zhì)量濃度為10 g/L時抑菌率即可達到50%以上，而黑龍江產(chǎn)五味子（又稱北五味子）效果最好。鐵箍散屬于五味子科五味子屬植物，該植物以根及葉入藥，可用于治療風濕麻木、跌打損傷、胃痛和脈管炎等疾病［11］。在本實驗中，鐵箍散的乙酸乙酯部位和氯仿∶丙酮=1∶1段的兩種不同提取物對大麗輪枝菌菌絲生長有較明顯的抑制作用。質(zhì)量濃度為10 g/L時，抑菌率分別為78.6%和82.1%。黃苞大戟作為一種植物藥材，主要用于腎炎水腫、腹脹、便秘、瘧疾、風濕和黃疸等疾病治療［12］。楊大松等［13］對黃苞大戟的化學成分進行研究后發(fā)現(xiàn)，其主要含有二萜、三萜和甾體等成分。本實驗結果證明，黃苞大戟的乙酸乙酯和正丁醇部位的中藥提取物在10g/L的濃度下，對大麗輪枝菌的抑菌率即可達到100%。這為黃苞大戟作為植物源提取物的抗病機理的研究提供了實驗依據(jù)。

圖2 黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物對大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病的抑制作用

3.2 同一種中藥提取物中可能存在多種對大麗輪

枝菌有抑制作用的活性成分本研究中，在中藥提取物質(zhì)量濃度為10 g/L時，遼寧產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段、遼寧產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=1∶1段和遼寧產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=9∶1后段對大麗輪枝菌的菌絲生長抑制率分別為82.1%、78.1%和64.3%。黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段和黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=10∶1段的菌絲生長抑制率分別為71.4%和57.1%。表明在同一植物中存在多種對大麗輪枝菌有活性抑制的成分，而且同一種中藥的不同產(chǎn)地也會影響抑菌效果。

3.3 黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段提取物對棉花黃萎病有較好的防治效果

實驗中有26種中藥提取物對大麗輪枝菌的菌絲生長表現(xiàn)出良好的抑制作用，但是在進行病情指數(shù)和防治效果測定中發(fā)現(xiàn)，其對大麗輪枝菌的菌絲生長抑制作用與防治效果并不一致。遼寧產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段在10 g/L質(zhì)量濃度下菌絲生長抑制率為82.1%，而防治效果為-109%，說明該提取物雖然可以有效抑制大麗輪枝菌的菌絲生長，但是在黃萎病防治效果方面較差。而黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段在10 g/L質(zhì)量濃度下菌絲生長抑制率為71.4%，平均防治效果為68.5%。表明該提取物不僅可以有效抑制大麗輪枝菌的菌絲生長，而且對棉花黃萎病有較好的防治效果。造成這種防治效果不同的原因或許是由于不同產(chǎn)地的五味子藥效成分的差異［14］，如南、北五味子其實不是同一種植物。

大麗輪枝菌侵染植物根部后，在適宜的環(huán)境下開始侵染維管束，隨著病原菌的不斷積累和擴展，感病植株開始出現(xiàn)一系列發(fā)病癥狀，包括萎蔫、褪綠、黃化、組織壞死、生長遲緩和維管束褐化［15-18］。通常認為維管束變色說明大麗輪枝菌已經(jīng)侵入植株，產(chǎn)生落葉癥狀的植株維管束褐化程度更高［19-20］。通過莖切片觀察發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為3 g/L的黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段可以有效抑制黃萎病引起的維管束褐化，并且落葉癥狀得到明顯抑制。說明該提取物可以誘導植株產(chǎn)生抗黃萎病效果。本實驗結果為研究和開發(fā)防治棉花黃萎病的新型生物農(nóng)藥提供了線索和依據(jù)。

4 結論

依據(jù)抑菌率、病情指數(shù)和防治效果的測定結果，黑龍江產(chǎn)五味子氯仿∶丙酮=3∶2段中藥提取物，不僅可以有效抑制大麗輪枝菌的菌絲生長，而且可以誘導植物產(chǎn)生對黃萎病的抗性作用。

［1］ 林玲, 張昕, 鄧晟. 棉花黃萎病研究進展［J］. 棉花學報,2014, 26（3）：260-267.

［2］ 李成偉, 丁錦平, 劉冬梅, 等. 棉花黃萎病及抗病育種研究進展［J］. 棉花學報 , 2008, 20（5）：385-390.

［3］ 石磊, 侯振安, 尹飛虎. 生物農(nóng)藥在棉花黃萎病防治上的研究與應用［J］. 新疆農(nóng)墾科技, 2017, 40（4）：25-28.

［4］ 朱荷琴, 馮自力, 宋曉軒, 劉雪英. 22種中藥提取物對棉花黃萎病菌的抑菌活性［J］. 棉花學報, 2007, 19（6）：489-492.

［5］ 孟慶華. 一種防治棉花黃萎病的復方中草藥制劑及其生產(chǎn)方法［P］. 中國專利：ZL201310045556. 8, 2014-3-5.

［6］ 王美入, 姚琴, 楊家榮, 等. 5種植物提取物及殘體對棉花黃萎病菌的抑制作用. 西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版, 2014,42（4）：137-142.

［7］ 王慶芳, 葉華智. 幾種化學物質(zhì)對茄子抗黃萎病的誘導作用［J］.中國蔬菜, 2008, 1（9）：24-27.

［8］ 朱荷琴, 宋曉軒, 簡桂良. 棉花黃萎病菌致病力變異生理機制的初步研究［J］. 棉花學報, 2004, 16（5）：275-279.

［9］ 曹靜, 客邵英, 王樹桐, 等. 15種中草藥提取物對馬鈴薯晚疫病的抑制效果［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2006, （4）：51-52.

［10］ 孔秋蓮, 張明融, 章麗麗. 中草藥提取物對兩種果蔬致腐真菌的抑制作用［J］. 保鮮與加工, 2002, 2（3）：17-18.

［11］ 尚善齋. 兩種五味子科和兩種木蘭科植物的化學成分及其生物活性研究［D］. 北京：中國科學院大學, 2013.

［12］ 范君文, 于錄, 馬蘭芝, 等. 29種中藥提取物抗結核藥物敏感性研究［J］. 中國農(nóng)學通報, 2009, 25（24）：1-7.

［13］ 楊大松, 魏建國, 楊永平, 等. 黃苞大戟化學成分研究［J］.中國中藥雜志. 2013, 38（23）：4094-4098.

［14］ 肖瑞穎, 王偉, 錢俊峰. 五味子不同產(chǎn)地、部位及提取工藝對木脂素成分含量影響的研究［J］. 天津藥學 , 2016, 28（5）：8-11.

［15］ Frappe EF, Thomma BPHJ. Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V. dahliae and V. alboatrum［J］. Molecular Plant Pathology, 2006, 7（2）：71-86.

［16］ 趙風軒, 戴小楓. 棉花黃萎病菌的侵染過程［J］. 基因組學與應用生物學, 2009, 28（4）：786-792.

［17］ Paplomatas EJ, Bassett DM, et al. Incidence of Verticillium wilt and yield losses of cotton cultivars based on soil inoculum density［J］.Phytopathology, 1992, 82（12）：1417-1420.

［18］ Pullman GS, Devay JE. Effect of soil flooding and paddy rice culture on the survival of Verticillium dabliae and incidence of Verticillium wilt in cotton［J］. Phytopathology, 1981, 71（12）：1285-1289.

［19］ 謝仲權, 牛樹琦. 天然植物飼料添加劑［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學與技術出版社, 2004.

［20］ 喬金玲, 胡永金. 植物源提取物抑菌機理及其應用研究進展［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2010, 22：275-279.