王洪洋 秦麗娟 唐唯 田振東

（1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2. 云南省芒市植保植檢站，芒市 678400；3. 農(nóng)業(yè)部馬鈴薯生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是繼水稻、小麥、玉米之后全球第四大重要糧食作物，在全世界158個國家廣泛種植（http://www.fao.org/statistics/zh/）。由致 病疫霉 菌（Phytophthora infestans（Mont.）de Bary）引起的馬鈴薯晚疫病嚴(yán)重威脅著全球馬鈴薯生產(chǎn)安全［1］。在長期自然進(jìn)化中，馬鈴薯形成了一套有效的免疫體系來抵擋各種病原菌人侵。同時病原菌為了侵染寄主，也形成了多種機(jī)制來克服馬鈴薯的防御反應(yīng)。P. infestans能夠在馬鈴薯中成功侵染并繁衍的一個關(guān)鍵因素就是通過吸器組織向植物細(xì)胞內(nèi)分泌一類具有“RXLR”保守結(jié)構(gòu)的效應(yīng)蛋白，抑制由病原菌的病原相關(guān)分子模式分子（Pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）激發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI），促使植物更易感病［2-6］。然而馬鈴薯則進(jìn)化出NB-LRR類抗病基因（Resistance gene toP. infestans，Rpi），其編碼蛋白直接或間接特異識別P. infestans中RXLR效應(yīng)蛋白，產(chǎn)生效應(yīng)子激發(fā)免疫反應(yīng)（Effector-triggered immunity，ETI）［7-8］。這些被 Rpi蛋白特異識別的RXLR效應(yīng)蛋白稱為無毒蛋白（Avirulence protein，AVR）。在馬鈴薯與P. infestans這一復(fù)雜的防御與侵染互作過程中，RXLR效應(yīng)蛋白起著關(guān)鍵的作用。本文以RXLR效應(yīng)蛋白為切入點(diǎn)，綜述了P.infestans的RXLR效應(yīng)子相關(guān)研究進(jìn)展，以期為RXLR效應(yīng)蛋白今后研究及P. infestans與馬鈴薯的互作機(jī)制研究提供較為系統(tǒng)而全面的參考信息。

1 致病疫霉RXLR效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)及基本功能

病原菌效應(yīng)蛋白及其功能研究是寄主與病原菌互作研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。真核病原菌分泌效應(yīng)蛋白途徑不同于原核細(xì)菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，可能主要是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基（ER-Golgi）的蛋白分泌系統(tǒng)［9］。病原菌效應(yīng)子必須被分泌并轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主細(xì)胞的特定區(qū)域才能發(fā)揮致病作用。根據(jù)效應(yīng)子在植物細(xì)胞的不同作用位置，效應(yīng)子一般分為胞質(zhì)效應(yīng)蛋白（Cytoplasmic effector）和質(zhì)外體效應(yīng)蛋白（Apoplastic effector）。致病疫霉RXLR胞質(zhì)效應(yīng)蛋白既可以作為致病因子促進(jìn)寄主植物感病，又可以作為無毒因子被抗病基因編碼蛋白識別激發(fā)寄主防御反應(yīng)［7］。RXLR效應(yīng)蛋白的主要特征是其N端含有一個15-25個疏水性氨基酸殘基組成的信號肽，信號肽后是保守的Arg-X-Leu-Arg（RXLR，X代表任意氨基酸）結(jié)構(gòu)域，以及多態(tài)性的C端效應(yīng)子功能域［10］。N端信號肽和RXLR結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)子分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入寄主細(xì)胞有關(guān)，而多態(tài)性的C端功能域則是病原菌用來調(diào)控寄主防御反應(yīng)和通過快速進(jìn)化從而躲避寄主抗病蛋白識別的關(guān)鍵區(qū)域［11］。

隨著基因組測序技術(shù)的飛快發(fā)展，2009年完成了P. infestans菌株T30-4全基因組的測序和組裝，研究發(fā)現(xiàn)P. infestans全基因組有240 Mb，預(yù)測有17 797個編碼基因，其中包含563個RXLR效應(yīng)子基因［12］。Raffaele等［13］對P. infestans的基因組骨架和基因表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，P. infestans基因組中有540個RXLR效應(yīng)子基因，且其中有97.4%都位于基因組轉(zhuǎn)座子區(qū)，變異率非常高，這些快速變異的RXLR效應(yīng)子有助于P. infestans快速的適應(yīng)寄主植物。Cooke等［14］對P. infestans的A2交配型的生理小種06_3928A進(jìn)行了全基因組測序，并與參考菌株T30-4全基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，405個RXLR效應(yīng)子基因SNP標(biāo)記中存在278個（69%）非同義替換，作者認(rèn)為這些多態(tài)型的RXLR效應(yīng)蛋白可能是導(dǎo)致P. infestans基因型13_A2菌株快速發(fā)展成為英國優(yōu)勢致病菌株的原因。RXLR效應(yīng)蛋白的快速進(jìn)化對P. infestans克服已有馬鈴薯抗病基因起著十分重要的作用。

2 RXLR效應(yīng)蛋白的毒性功能

已有研究顯示P. infestans能夠分泌RXLR效應(yīng)子到寄主細(xì)胞內(nèi)以干擾植物免疫反應(yīng)，RXLR效應(yīng)子扮演著毒性因子的角色，但是目前絕大多數(shù)效應(yīng)子如何發(fā)揮其毒性功能還不清楚。通過轉(zhuǎn)錄組分析，研究者發(fā)現(xiàn)至少79個RXLR效應(yīng)子基因在P.infestans接種寄主后2-3 d內(nèi)表達(dá)量顯著增高［12］。這些效應(yīng)子理論上在抑制植物PTI免疫、調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子、蛋白降解、信號傳導(dǎo)、泛素化等方面發(fā)揮著重要功能。

目前，部分P. infestans侵染前期上調(diào)表達(dá)的RXLR效應(yīng)子基因亞細(xì)胞定位、寄主標(biāo)靶及其功能已有研究報道（表 1）。McLellan等［2］研究發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)子PITG_03192的寄主靶標(biāo)是馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因 子 StNTP1和 StNTP2，PITG_03192抑 制 StNTP1和StNTP2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)P.infestans侵染。絲裂原活化蛋白激酶在植物免疫信號傳導(dǎo)途徑中起著重要作用［15］。King等［3］報道效應(yīng)子PexRD2可以特異結(jié)合并抑制植物絲裂原活化蛋白激酶MAPKKKε的激酶活性，進(jìn)而干擾植物免疫相關(guān)信號傳導(dǎo)，致使植物更容易感?。?］。P.infestans基因組中存在數(shù)百個RXLR效應(yīng)子基因，研究發(fā)現(xiàn)RXLR效應(yīng)子具有功能冗余性，一部分RXLR效應(yīng)子執(zhí)行同樣的功能。Zheng等［4］通過在番茄原生質(zhì)體中表達(dá)33個致病疫霉RXLR效應(yīng)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn) PITG_04097、PITG_04145、PITG_06087、PITG_09585、PITG_13628、PITG_13959、PITG_18215和PITG_20303等8個效應(yīng)子可以抑制病原相關(guān)分子模式flg22激發(fā)的早期PTI免疫反應(yīng)，同樣在番茄上有3個RXLR效應(yīng)子（PITG_13628，PITG_13959，PITG_18215）能夠抑制番茄中MAP激酶活性，干擾植物抗病信號傳導(dǎo)。Dagdas等［16］利用免疫共沉淀技術(shù)在本式煙草上篩選到RXLR效應(yīng)子PexRD54（PITG_09316）的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)PexRD54與植物自噬蛋白ATG8CL互作并加速細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成，同時大大減弱了自噬運(yùn)輸受體Joka2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Wang等［17］發(fā)現(xiàn)在本氏煙草中瞬時表達(dá)細(xì)胞核（nucleus）定位RXLR效應(yīng)子PITG_22798可以激發(fā)細(xì)胞死亡，核定位突變后PITG_22798不能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞死亡。該細(xì)胞死亡依賴SGT1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，并可以被P. infestans無毒蛋白AVR3b抑制。

植物體內(nèi)存在一類蛋白，能夠被病原菌利用并促進(jìn)病原菌侵染，即感病因子（Susceptibility factor，S factor）。在寄主植物中沉默或突變感病因子有助于增強(qiáng)植物抗病性［18-20］。Wang等［21］研究首次發(fā)現(xiàn)P. infestans細(xì)胞核定位效應(yīng)子PITG_04089可以通過與感病因子RNA結(jié)合蛋白StKRBP1互作并調(diào)控StKRBP1的積累來促進(jìn)P. infestans侵染。另外作者還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核定位對于效應(yīng)子PITG_04089發(fā)揮毒性功能至關(guān)重要。Boevink等［6］發(fā)現(xiàn)RXLR效應(yīng)子PITG_04314雖然可以與植物蛋白磷酸酶PP1c催化亞基產(chǎn)生互作，并促進(jìn)PP1c從核仁轉(zhuǎn)運(yùn)到核質(zhì)，但是PITG_04314并沒有影響PP1c的磷酸酶活性。研究者推測效應(yīng)子PITG_04314是通過與PP1c發(fā)生互作形成PITG_04314- PP1c復(fù)合體全酶形式負(fù)調(diào)控植物防御反應(yīng)。在馬鈴薯中超量表達(dá)PITG_04314基因，JA-和SA-響應(yīng)報告基因明顯表達(dá)下調(diào)。同樣效應(yīng)子PITG_04314發(fā)揮毒性功能與其細(xì)胞核定位關(guān)聯(lián)。Yang等［5］研究發(fā)現(xiàn)RXLR效應(yīng)子PITG_02860可以與感病因子StNRL1互作調(diào)控植物免疫反應(yīng)，另外只有當(dāng)PITG_02860基因在細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）中表達(dá)時，PITG_02860才能抑制INF1（P. infestans的PAMP）介導(dǎo)的HR反應(yīng)和促進(jìn)植物感病。

3 無毒蛋白

表1 已報道毒性RXLR效應(yīng)子亞細(xì)胞定位及寄主靶標(biāo)

目前報道的所有P. infestans無毒蛋白（AVR）均屬于RXLR類效應(yīng)蛋白，同樣具有N端信號肽、RXLR結(jié)構(gòu)域和C-端功能域，無毒基因具有在P.infestans侵染前期上調(diào)表達(dá)的特點(diǎn)［10］。P. infestans的AVR基因與馬鈴薯Rpi基因間的互作識別符合“基因?qū)颉蹦Ｐ停?2］。當(dāng)這些AVR蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，會抑制病原菌PAMP激發(fā)的PTI免疫途徑，然而當(dāng)寄主細(xì)胞內(nèi)有對應(yīng)的Rpi基因存在時，Rpi蛋白會特異識別這些AVR蛋白，從而激發(fā)ETI免疫途徑，使馬鈴薯產(chǎn)生抗病性。近年來，關(guān)于P. infestans的AVR基因的克隆、亞細(xì)胞定位、寄主靶標(biāo)及功能等方面的研究已有很好的進(jìn)展（表2）。

3.1 無毒基因的功能研究

目前，已被克隆的P. infestans的AVR基因已有10 個， 即AVR1［23］、AVR2［24］、AVR3a［25］、AVR3-b［26］、AVR4［27］、AVR-blb1［28］、AVR-blb2［29］、AVR-vnt1［30］、AVRSmira1［31］和AVRSmira2/AVR8［31-32］。

AVR3a是第一個從P. infestans中克隆到的RXLR類無毒基因［25］。研究發(fā)現(xiàn)AVR3a可以與植物E3泛素連接酶CMPG1和GTP酶DRP2互作，從而抑制INF1和flg22介導(dǎo)的PTI免疫反應(yīng)，促進(jìn)P.infestans侵染植物［33-34］。Rpi-R3a和AVR3a的識別互作模式目前尚不清楚。雖然AVR3a和Rpi-R3a可以共定位在植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)涵體中激發(fā)HR反應(yīng)，但是酵母雙雜交和免疫共沉淀均不能證明AVR3a和Rpi-R3a直接互作［35］。另外沉默CMPG1不影響Rpi-R3a識別AVR3a激發(fā)HR反應(yīng)，說明CMPG1不是Rpi-R3a識別AVR3a信號途徑中的關(guān)鍵因子［36］。

表2 已報道的P. infestans無毒基因

研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)AVR1和Rpi-R1均在細(xì)胞核中表達(dá)時，Rpi-R1才能識別AVR1并激發(fā)HR反應(yīng)。當(dāng)AVR1在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)時，可以抑制效應(yīng)子CRN2介導(dǎo)的細(xì)胞死亡反應(yīng)［23］。通過酵母雙雜交和免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)AVR1與蛋白復(fù)合體exocyst的一個亞基Sec5互作，可能干擾植物防御中細(xì)胞囊泡運(yùn)輸途徑。AVR1通過抑制Sec5從而導(dǎo)致病程相關(guān)蛋白PR-1分泌減少和降低P. infestans接種點(diǎn)處胼胝質(zhì)積累，使植物免疫能力下降。Sec5是否在Rpi-R1識別AVR1反應(yīng)途徑中扮演重要角色有待進(jìn)一步研究［37］。

AVR2和AVR-blb2主要在植物細(xì)胞質(zhì)膜（Plasma membrane，PM）和P. infestans侵染點(diǎn)處吸器組織內(nèi)表達(dá)［24，38-39］。AVR-blb2可通過與植物防御相關(guān)木瓜蛋白酶C14互作，抑制其在質(zhì)外體內(nèi)積累，從而干擾植物防御反應(yīng)［38］。另外，研究發(fā)現(xiàn)Rpi-blb2識別AVR-blb2激發(fā)的HR反應(yīng)依賴SGT1，不需要水楊酸、茉莉酸或者乙烯介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑［40］。馬鈴薯磷酸酶StBSL1蛋白參與油菜素內(nèi)脂信號傳導(dǎo)，調(diào)控生長和發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)P. infestans無毒蛋白AVR2與StBSL1形成復(fù)合體進(jìn)而被抗病蛋白Rpi-R2識別、激發(fā)HR反應(yīng)，Rpi-R2和AVR2識別免疫反應(yīng)符合“警戒”假說［24］?；蛐酒治霭l(fā)現(xiàn)，表達(dá)AVR2的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中參與油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子StCHL1組成型表達(dá)，瞬時超量表達(dá)StCHL1和AVR2促進(jìn)植物感病，沉默StCHL1基因則增強(qiáng)馬鈴薯對P. infestans的抵抗能力。研究者指出，AVR2是通過激活植物油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)間接抑制INF1介導(dǎo)植物PTI免疫反應(yīng)，促進(jìn)植物感?。?1］。

AVR3b定位在植物細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上，可以抑制flg22介導(dǎo)的早期PTI免疫反應(yīng)和番茄中MAP激酶活性，干擾植物抗病信號傳導(dǎo)，促進(jìn)P. infestans侵染［4］。目前尚未發(fā)現(xiàn)AVR3b在植物體內(nèi)的寄主靶標(biāo)蛋白，其致病分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究。PVX-agroinfection分析發(fā)現(xiàn)AVR4可以被含有Rpi-R4的馬鈴薯材料識別并激發(fā)HR反應(yīng)，其C-端W基序是蛋白識別的關(guān)鍵區(qū)域［42］。同樣有關(guān)AVR4的寄主靶標(biāo)蛋白未見有報道。

在P. infestans無毒蛋白（AVR）和馬鈴薯抗晚疫病蛋白（Rpi）互作識別模式研究中，AVR-blb1（IPI-O1）與Rpi-blb1符合直接互作識別模式。研究發(fā)現(xiàn)Rpi-blb1中CC結(jié)構(gòu)域是與AVR-blb1互作的重要結(jié)構(gòu)域。AVR-blb1蛋白結(jié)構(gòu)中第129位亮氨酸對Rpi-blb1識別AVR-blb1激發(fā)HR起到關(guān)鍵作用，突變第129位亮氨酸（L129P）則導(dǎo)致Rpi-blb1不能與AVR-blb1互作，也不能產(chǎn)生HR。另外AVR-blb1的毒性蛋白形式IPI-O4也可以與Rpi-blb1直接互作。研究者指出P. infestans的AVR-blb1毒性形式IPI-O4通過與IPI-O1競爭互作Rpi-blb1，使Rpiblb1處于非激活狀態(tài)，進(jìn)而大大減弱植物ETI免疫反應(yīng)［43］。另外，研究發(fā)現(xiàn)，AVR-blb1還可以通過細(xì)胞黏附基序RGD與擬南芥中的凝集素受體激酶LecRK-I.9發(fā)生互作。超量表達(dá)LecRK-I.9增強(qiáng)擬南芥對P. brassicae的抗性，突變LecRK-I.9和超量表達(dá)AVR-blb1導(dǎo)致病原菌接種點(diǎn)處胼胝質(zhì)的積累減弱，促使擬南芥感?。?4］。

AVR-vnt1可以被Rpi-vnt1和Rpi-phu1識別并激發(fā)抗性反應(yīng)［30，45］。研究發(fā)現(xiàn)P. infestans毒性生理小種（MP324x和MP1580）在無Rpi-phu1的馬鈴薯中侵染時還是會表達(dá)AVR-vnt1，只是在含Rpi-phu1的馬鈴薯上會通過基因沉默等方式不表達(dá)AVR-vnt1以躲避Rpi-phu1等抗病蛋白的識別以達(dá)到致病目的［45］。另外，通過效應(yīng)子組學(xué)策略研究發(fā)現(xiàn)，部分RXLR效應(yīng)子可以作為候選無毒蛋白被辣椒、龍葵識別并激發(fā)HR反應(yīng)，參與了P. infestans的非寄主抗性免疫途徑［46-47］。

3.2 無毒基因的進(jìn)化與變異

P. infestans生理小種的變化和區(qū)域分布是影響馬鈴薯品種抗病性能否持久的主要因素之一，了解AVR基因在小種間的變化不僅有助于揭示AVR基因進(jìn)化變異的過程，同時也可以檢測生理小種的變化，為選育抗病品種以及生產(chǎn)中抗病品種/抗源合理利用提供依據(jù)。P. infestans數(shù)百個RXLR效應(yīng)子基因中，AVR基因可以通過基因缺失、序列多態(tài)性或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)等變異機(jī)制來幫助P. infestans躲避對應(yīng)抗病蛋白的識別（表3）。

AVR基因缺失，主要表現(xiàn)在基因編碼序列的全部與部分缺失，基因上下游序列的全部與部分缺失［51］。通過與參考菌株T30-4基因組比對，Pais等［52］發(fā)現(xiàn)P. infestans菌株 P13527中有 62個基因缺失，菌株P(guān)13626中有60個基因缺失。AVR1、AVR2、AVR3b和AVR-blb1在P. infestans不同生理小種中均存在基因缺失［23，53-55］。研究發(fā)現(xiàn)，能夠克服Rpi-R1的一個P. infestans毒性菌株中缺失AVR1基因，但是在相同位置上存在一個AVR1-like基因。AVR1-like蛋白同樣是RXLR效應(yīng)子，AVR1-like的C端缺失38個氨基酸，導(dǎo)致了AVR1-like不能被Rpi-R1識別［23］。通過在29個P. infestans生理小種中擴(kuò)增AVR2基因，測序分析發(fā)現(xiàn)12個克服Rpi-R2的毒性菌株中有9個菌株缺失AVR2，在剩余3株毒性菌株和17株無毒菌株中AVR2存在序列多態(tài)性變異。另外在毒性菌株中克隆出AVR2-like，經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)AVR2-like與AVR2存在13個氨基酸差異，且AVR2-like不能被Rpi-R2識別。研究者指出毒性P. infestans菌株中AVR2主要通過缺失、差異表達(dá)及序列多態(tài)性變異逃避Rpi-R2識別致使植物感?。?3］。對多個P. infestans菌株中編碼的AVR-blb1（IPI-O）基因家族進(jìn)行測序與分析，發(fā)現(xiàn)16種IPI-O蛋白變異型。根據(jù)氨基酸序列差異比對，將這16個差異蛋白可分成3組，其中第一組和第二組的變異型可以被Rpi-blb1識別，第三組的IPI-O4不能被Rpi-blb1識別，而且還與IPI-O1競爭互作Rpi-blb1，從而阻斷 Rpi-blb1 介導(dǎo)的抗病免疫反應(yīng)［43，54，56］。

基因序列多態(tài)性包括堿基序列多態(tài)性、點(diǎn)突變等。AVR3a在P. infestans毒性菌株主要通過氨基酸點(diǎn)突變變異成毒性基因，毒性基因和無毒基因序列的差異主要在3個氨基酸位點(diǎn)，其中一個位于信號肽，另外兩個位于C端功能域。攜帶 Avr3aC19K80I103的P. infestans菌株對于含有Rpi-R3a馬鈴薯表現(xiàn)無毒性，而攜帶Avr3aS19E80M103菌株表現(xiàn)為毒性。研究表明AVR3a蛋白序列中第80位、103位的氨基酸對Rpi-R3a識別AVR3a具有重要作用［25］。目前發(fā)現(xiàn)AVR4的毒性形態(tài)主要是發(fā)生了移碼突變，導(dǎo)致基因短截，從而逃避了抗病蛋白的識別［27］。利用基于SNP策略對來自23個馬鈴薯主產(chǎn)國家采集的352株P(guān). infestans菌株進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)AVR-blb2基因家族的多態(tài)性很高，且第69位氨基酸的點(diǎn)突變（F69I）對Rpi-blb2識別激活具有關(guān)鍵作用［57］。Stefańczyk 等［45］對 4 個P. infestans強(qiáng)致病生理小種中AVR-smira1基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AVR-smira1在這4個小種中均有非同義突變。

病原菌中無毒基因選擇性表達(dá)也是毒性變異的一種策略［58］。Pais等［52］通過對P. infestans基因組和基因表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，17個基因在P13626菌株中不表達(dá)，AVR-vnt1是其中之一，在含有Rpivnt1.1的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯上接種P13626表現(xiàn)感病。研究者認(rèn)為菌株P(guān)13626中AVR-vnt1未轉(zhuǎn)錄表達(dá)避開了寄主Rpi-vnt1.1的識別而促進(jìn)植物感病。

表3 無毒基因與抗病基因的互作模式及其在毒性小種中的變異形式

4 展望

RXLR效應(yīng)蛋白在致病疫霉與寄主互作中起著關(guān)鍵作用。一方面，RXLR效應(yīng)蛋白作為無毒蛋白被寄主抗病蛋白識別激發(fā)植物免疫反應(yīng)；另一方面，RXLR效應(yīng)蛋白作為致病疫霉抑制寄主免疫應(yīng)答的關(guān)鍵武器，促進(jìn)植物感?。?0］。通過對RXLR效應(yīng)蛋白功能及其作用機(jī)制的研究有助于進(jìn)一步深入了解致病疫霉與寄主間互作機(jī)制，從理論上指導(dǎo)探索晚疫病防治的新策略和技術(shù)。

4.1 RXLR效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

卵菌分泌效應(yīng)蛋白途徑不同于原核細(xì)菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，可能主要是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基（ERGolgi）的蛋白分泌系統(tǒng)［9］。基于卵菌基因組的研究表明，卵菌基因組中有一類數(shù)目眾多的編碼帶保守RXLR序列的分泌蛋白基因［12］。RXLR效應(yīng)子如何被分泌轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞內(nèi)從而調(diào)節(jié)寄主代謝和免疫反應(yīng)呢？Kale等［61］研究RXLR效應(yīng)子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制主要是通過RXLR或RXLR-like基序與植物細(xì)胞膜3-磷酸磷脂酰肌醇分子（PI3P）結(jié)合而進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)。但這一結(jié)論并不能適用于所有RXLR效應(yīng)蛋白，如效應(yīng)子AVR3a和AVR1d均是C端效應(yīng)子功能域與磷脂類分子結(jié)合，而不是RXLR結(jié)構(gòu)域［62-63］。Wawra等［64］發(fā)現(xiàn)AVR3a在被分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞前，其RXLR基序就已經(jīng)被切除，研究表明RXLR基序在AVR3a蛋白修飾和分泌方面起到一定作用，但并沒有直接參與AVR3a轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞的過程。Ve等［65］證明亞麻銹菌的無毒蛋白AVR-M轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)需要N-疏水區(qū)域，而不需要可以與3-磷酸磷脂酰肌醇分子結(jié)合的C-端CC結(jié)構(gòu)域。Wang等［66］發(fā)現(xiàn)RXLR效應(yīng)子PITG_04314與質(zhì)外體效應(yīng)子EPIC1在P. infestans體內(nèi)的分泌途徑不同，即質(zhì)外體效應(yīng)子EPIC1是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基（ER-Golgi）的蛋白分泌系統(tǒng)，而RXLR效應(yīng)子PITG_04314則是通過另外一種特殊分泌系統(tǒng)。另外，有的RXLR效應(yīng)子不依賴病原菌編碼機(jī)制也可以自主地進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，如AVR1b［67］。RXLR效應(yīng)子的轉(zhuǎn)運(yùn)過程非常復(fù)雜，還需要更多的研究來揭示RXLR效應(yīng)蛋白是如何被轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主細(xì)胞中的。

4.2 RXLR效應(yīng)蛋白的靶標(biāo)蛋白功能解析

致病疫霉基因組中存在數(shù)百個編碼RXLR效應(yīng)子的基因，這些效應(yīng)子進(jìn)入寄主細(xì)胞后通過與寄主靶標(biāo)蛋白結(jié)合來調(diào)控寄主免疫應(yīng)答反應(yīng)［39］。有些RXLR效應(yīng)子靶標(biāo)蛋白對寄主抗性起正調(diào)控作用， 如 Sec5［37］，C14［38］，LecRK-I.9［44］等， 在 寄主中增強(qiáng)此類基因的表達(dá)會提高抗性；有些靶標(biāo)對寄主抗性起負(fù)調(diào)控作用，如 StNRL1［5］，PP1c［6］，StKRBP1［21］等，這些基因在寄主中增強(qiáng)表達(dá)會導(dǎo)致寄主抗性下降。靶標(biāo)蛋白對解析效應(yīng)子調(diào)控寄主免疫應(yīng)答機(jī)制和如何提高馬鈴薯抗性具有重要作用。但是，絕大多數(shù)RXLR效應(yīng)子在寄主植物中的互作靶標(biāo)仍然不清楚。系統(tǒng)解析晚疫病菌核心效應(yīng)子如何通過操控寄主靶標(biāo)蛋白抑制寄主免疫應(yīng)答反應(yīng)，可為將來通過在寄主中加強(qiáng)被效應(yīng)子抑制的正調(diào)控因子，同時抑制負(fù)調(diào)控因子作用來提高馬鈴薯持久抗性提供新思路。

4.3 P. infestans中AVR蛋白與馬鈴薯Rpi蛋白間的互作機(jī)制

近年來，由于效應(yīng)子組學(xué)策略的發(fā)展和應(yīng)用，大大加速了P. infestans的AVR和馬鈴薯Rpi基因的克?。?8］，但是P. infestans中的AVR蛋白與馬鈴薯Rpi蛋白之間的精細(xì)互作機(jī)制報道很少。迄今為止只有兩篇相關(guān)報道，即Rpi-blb1直接互作識別AVR-blb1，Rpi-R2 間接識別 AVR2［24，43］。另外有關(guān) RXLR效應(yīng)子直接或間接抑制效應(yīng)子激發(fā)免疫反應(yīng)（ETI）的研究報道也不多［7，39］。因此，對已克隆的AVR和對應(yīng)Rpi的互作機(jī)制還需要更深入研究。同時，如何將P. infestans與馬鈴薯互作機(jī)理的研究成果應(yīng)用于P. infestans群體組成、小種變化動態(tài)監(jiān)測、指導(dǎo)抗病品種選育，抗源合理布局及延長抗性品種使用年限等，還有待更深入系統(tǒng)的研究。

［1］謝從華. 馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與發(fā)展［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：社會科學(xué)版, 2012, （1）：1-4.

［2］McLellan H, Boevink PC, Armstrong MR, et al. An RxLR effector from Phytophthora infestans prevents re-localisation of two plant NAC transcription factors from the endoplasmic reticulum to the nucleus［J］. PLoS Pathog, 2013, 9（10）：e1003670.

［3］King SR, McLellan H, Boevink PC, et al. Phytophthora infestans RXLR effector PexRD2 interacts with host MAPKKK epsilon to suppress plant immune signaling［J］. Plant Cell, 2014, 26（3）：1345-1359.

［4］Zheng X, McLellan H, Fraiture M, et al. Functionally redundant RXLR effectors from Phytophthora infestans act at different steps to suppress early flg22-triggered immunity［J］. PLoS Pathog, 10（4）：e1004057.

［5］Yang L, McLellan H, Naqvi S, et al. Potato NPH3/RPT2-Like protein StNRL1, targeted by a Phytophthora infestans RXLR effector, is a susceptibility factor［J］. Plant Physiol, 2016, 171（1）：645-657.

［6］Boevink PC, Wang X, McLellan H, et al. A Phytophthora infestans RXLR effector targets plant PP1c isoforms that promote late blight disease［J］. Nat Commun, 2016, 7：10311.

［7］Hein I, Gilroy EM, Armstrong MR, et al. The zig-zag-zig in oomyceteplant interactions［J］. Mol Plant Pathol, 2009, 10（4）：547-562.

［8］Franceschetti M, Maqbool A, Jimenez-Dalmaroni MJ, et al. Effectors of filamentous plant pathogens：commonalities amid diversity［J］.Microbiol Mol Biol Rev, 2017, 81（2）：e00066-16.

［9］Petre B, Kamoun S. How do filamentous pathogens deliver effector proteins into Plant Cells?［J］. PLoS Biol, 2014, 12（2）：e1001801.

［10］Vleeshouwers VG, Raffaele S, Vossen JH, et al. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors［J］. Annu Rev Phytopathol, 2011, 49：507-531.

［11］Birch PR, Boevink PC, Gilroy EM, et al. Oomycete RXLR effectors：delivery, functional redundancy and durable disease resistance［J］. Curr Opin Plant Biol, 2008, 11（4）：373-379.

［12］Haas BJ, Kamoun S, Zody MC, et al. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans［J］.Nature, 2009, 461（7262）：393-398.

［13］Raffaele S, Win J, Cano LM, et al. Analyses of genome architecture and gene expression reveal novel candidate virulence factors in the secretome of Phytophthora infestans［J］. BMC genomics, 2010,11：637.

［14］Cooke DE, Cano LM, Raffaele S, et al. Genome analyses of an aggressive and invasive lineage of the Irish potato famine pathogen［J］. PLoS Pathog, 2012, 8（10）：e1002940.

［15］Segonzac C, Feike D, Gimenez-Ibanez S, et al. Hierarchy and roles of pathogen-associated molecular pattern-induced responses in Nicotiana benthamiana［J］. Plant Physiol, 2011, 156（2）：687-699.

［16］Dagdas YF, Belhaj K, Maqbool A, et al. An effector of the Irish potato famine pathogen antagonizes a host autophagy cargo receptor［J］. Elife, 2016, 5 ：e10856.

［17］Wang H, Ren Y, Zhou J, et al. The cell death triggered by the nuclear localized RxLR effector PITG_22798 from Phytophthora infestans is suppressed by the effector AVR3b［J］. Int J Mol Sci,2017, 18（2）：E409.

［18］Boevink PC, McLellan H, Gilroy EM, et al. Oomycetes seek help from the plant：Phytophthora infestans effectors target host susceptibility factors［J］. Mol Plant, 2016, 9（5）：636-638.

［19］Sun K, Wolters AM, Loonen AE, et al. Down-regulation of Arabidopsis DND1 orthologs in potato and tomato leads to broadspectrum resistance to late blight and powdery mildew［J］.Transgenic Res, 2016, 25（2）：123-138.

［20］Sun K, Wolters AM, Vossen JH, et al. Silencing of six susceptibility genes results in potato late blight resistance［J］. Transgenic Res,2016, 25（5）：731-742.

［21］Wang X, Boevink P, McLellan H, et al. A Host KH RNA-binding protein is a susceptibility factor targeted by an RXLR effector to promote late blight disease［J］. Mol Plant, 2015, 8（9）：1385-1395.

［22］Flor H. Current status of the gene-for-gene concept［J］. Annu Rev Phytopathol, 1971, 9：275-296.

［23］Du Y, Berg J, Govers F, et al. Immune activation mediated by the late blight resistance protein R1 requires nuclear localization of R1 and the effector AVR1［J］. New Phytol, 2015, 207（3）：735-747.

［24］Saunders DG, Breen S, Win J, et al. Host protein BSL1 associates with Phytophthora infestans RXLR effector AVR2 and the Solanum demissum immune receptor R2 to mediate disease resistance［J］.Plant Cell, 2012, 24（8）：3420-3434.

［25］Armstrong MR, Whisson SC, Pritchard L, et al. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm［J］. Proc Natl Academy of Sciences, 2005, 102（21）：7766-7771.

［26］Li G, Huang S, Guo X, et al. Cloning and characterization of R3b；members of the r3 superfamily of late blight resistance genes show sequence and functional divergence［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2011, 24（10）：1132-1142.

［27］van Poppel PM, Guo J, van de Vondervoort PJ, et al. The Phytophthora infestans avirulence gene Avr4 encodes an RXLR-dEER effector［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2008, 21（11）：1460-1470.

［28］Vleeshouwers VG, Rietman H, Krenek P, et al. Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes［J］. PLoS One, 2008, 3（8）：e2875.

［29］Oh SK, Young C, Lee M, et al. In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes,including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2［J］. Plant Cell, 2009, 21（9）：2928-2947.

［30］Pel M. Mapping, isolation and characterization of genes responsible for late blight resistance in potato［D］. Wageningen：Wageningen University, 2010.

［31］Rietman H, Bijsterbosch G, Cano LM, et al. Qualitative and quantitative late blight resistance in the potato cultivar Sarpo Mira is determined by the perception of five distinct RXLR effectors［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2012, 25（7）：910-919.

［32］Vossen JH, van Arkel G, Bergervoet M, et al. The Solanum demissum R8 late blight resistance gene is an Sw-5 homologue that has been deployed worldwide in late blight resistant varieties［J］.Theor Appl Genet, 2016, 129（9）：1785-1796.

［33］Bos JI, Armstrong MR, Gilroy EM, et al. Phytophthora infestans effector AVR3a is essential for virulence and manipulates plant immunity by stabilizing host E3 ligase CMPG1［J］. Proc Natl Academy of Sciences, 2010, 107（21）：9909-9914.

［34］Chaparro-Garcia A, Schwizer S, Sklenar J, et al. Phytophthora infestans RXLR-WY effector AVR3a associates with Dynamin-related protein 2 required for endocytosis of the plant pattern recognition receptor FLS2［J］. PLoS One, 2015, 10（9）：e0137071.

［35］Engelhardt S, Boevink PC, Armstrong MR, et al. Relocalization of late blight resistance protein R3a to endosomal compartments is associated with effector recognition and required for the immune response［J］. Plant Cell, 2012, 24（12）：5142-5158.

［36］Gilroy EM, Taylor RM, Hein I, et al. CMPG1-dependent cell death follows perception of diverse pathogen elicitors at the host plasma membrane and is suppressed by Phytophthora infestans RXLR effector AVR3a［J］. New Phytol, 2011, 190（3）：653-666.

［37］Du Y, Mpina MH, Birch PR, et al. Phytophthora infestans RXLR effector AVR1 interacts with exocyst component Sec5 to manipulate plant immunity［J］. Plant Physiol, 2015, 169（3）：1975-1990.

［38］Bozkurt TO, Schornack S, Win J, et al. Phytophthora infestans effector AVRblb2 prevents secretion of a plant immune protease at the haustorial interface［J］. Proc Natl Academy of Sci, 2011, 108（51）：20832-20837.

［39］Whisson SC, Boevink PC, Wang S, et al. The cell biology of late blight disease［J］. Curr Opin Microbiol, 2016, 34：127-135.

［40］Oh SK, Kwon SY, Choi D. Rpi-blb2-mediated hypersensitive cell death caused by Phytophthora infestans AVRblb2 requires SGT1,but not EDS1, NDR1, salicylic acid-, jasmonic Acid-, or ethylenemediated signaling［J］. Plant Pathol J, 2014, 30（3）：254-260.

［41］Turnbull D, Yang L, Naqvi S, et al. RXLR effector AVR2 upregulates a brassinosteroid-responsive bHLH transcription factor to suppress immunity［J］. Plant Physiol, 2017, 174（1）：356-369.

［42］VAN Poppel PM, Jiang RH, Sliwka J, et al. Recognition of Phytophthora infestans Avr4 by potato R4 is triggered by C-terminal domains comprising W motifs［J］. Mol Plant Pathol, 2009, 10（5）：611-620.

［43］Chen Y, Liu Z, Halterman DA. Molecular determinants of resistance activation and suppression by Phytophthora infestans effector IPIO［J］. PLoS Pathog, 2012, 8（3）：e1002595.

［44］Bouwmeester K, de Sain M, Weide R, et al. The lectin receptor kinase LecRK-I. 9 is a novel Phytophthora resistance component and a potential host target for a RXLR effector［J］. PLoS Pathog,2011, 7（3）：e1001327.

［45］Stefańczyk E, Sobkowiak S, Brylinska M, et al. Expression of the potato late blight resistance gene Rpi-phu1 and Phytophthora infestans effectors in the compatible and incompatible interactions in potato［J］. Phytopathology, 2017, 107（6）：740-748.

［46］Lee HA, Kim SY, Oh SK, et al. Multiple recognition of RXLR effectors is associated with nonhost resistance of pepper against Phytophthora infestans［J］. New Phytol, 2014, 203（3）：926-938.

［47］董冉. 馬鈴薯晚疫病菌四個RxLR基因的功能鑒定［D］. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

［48］Guo J. Phytophthora infestans avirulence genes；mapping,cloning and diversity in field isolates［D］. Wageningen, The Netherlands：Wageningen University, 2008.

［49］Lokossou AA, Park TH, van Arkel G, et al. Exploiting knowledge of R/Avr genes to rapidly clone a new LZ-NBS-LRR family of late blight resistance genes from potato linkage group IV［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2009, 22（6）：630-641.

［50］Lenman M, Ali A, Muhlenbock P, et al. Effector-driven marker development and cloning of resistance genes against Phytophthora infestans in potato breeding clone SW93-1015［J］. Theor Appl Genet, 2016, 129（1）：105-115.

［51］姜華, 余歡, 王艷麗, 等. 稻瘟病菌無毒基因序列變異研究進(jìn)展［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2015, 27（3）：512-520.

［52］Pais M, Yoshida K, Giannakopoulou A, et al. Gene expression polymorphism underpins evasion of host immunity in an asexual lineage of the Irish potato famine pathogen［J］. BioRxiv, 2017,116012.

［53］Gilroy EM, Breen S, Whisson SC, et al. Presence/absence,differential expression and sequence polymorphisms between PiAVR2 and PiAVR2-like in Phytophthora infestans determine virulence on R2 plants［J］. New Phytol, 2011, 191（3）：763-776.

［54］Champouret N, Bouwmeester K, Rietman H, et al. Phytophthora infestans isolates lacking class I ipiO variants are virulent on Rpiblb1 potato［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2009, 22（12）：1535-1545.

［55］Yoshida K, Schuenemann VJ, Cano LM, et al. The rise and fall of the Phytophthora infestans lineage that triggered the Irish potato famine［J］. Elife, 2013, 2：e00731.

［56］Halterman DA, Chen Y, Sopee J, et al. Competition between Phytophthora infestans effectors leads to increased aggressiveness on plants containing broad-spectrum late blight resistance［J］.PLoS One, 2010, 5（5）：e10536.

［57］Oliva RF, Cano LM, Raffaele S, et al. A recent expansion of the RXLR effector gene Avrblb2 is maintained in global populations of Phytophthora infestans indicating different contributions to virulence［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2015, 28（8）：901-912.

［58］Qutob D, Tedman-Jones J, Dong S, et al. Copy number variation and transcriptional polymorphisms of Phytophthora sojae RXLR effector genes Avr1a and Avr3a［J］. PLoS One, 2009, 4（4）：e5066.

［59］Bos JI, Kanneganti TD, Young C, et al. The C-terminal half of Phytophthora infestans RXLR effector AVR3a is sufficient to trigger R3a-mediated hypersensitivity and suppress INF1-induced cell death in Nicotiana benthamiana［J］. Plant J, 2006, 48（2）：165-176.

［60］Birch PR, Armstrong M, Bos J, et al. Towards understanding the virulence functions of RXLR effectors of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans［J］. J Exp Bot, 2009, 60（4）：1133-1140.

［61］Kale SD, Gu B, Capelluto DG, et al. External lipid PI3P mediates entry of eukaryotic pathogen effectors into plant and animal host cells［J］. Cell, 2010, 142（2）：284-295.

［62］Wawra S, Agacan M, Boddey JA, et al. Avirulence protein 3a（AVR3a）from the potato pathogen Phytophthora infestans forms homodimers through its predicted translocation region and does not specifically bind phospholipids［J］. J Biol Chem, 2012, 287（45）：38101-38109.

［63］Na R, Yu D, Qutob D, et al. Deletion of the Phytophthora sojae avirulence gene Avr1d causes gain of virulence on Rps1d［J］. Mol Plant Microbe Interact, 2013, 26（8）：969-976.

［64］Wawra S, Trusch F, Matena A, et al. The RxLR Motif of the host targeting effector AVR3a of Phytophthora infestans is cleaved before secretion［J］. Plant Cell, 2017, 29（6）：1184-1195.

［65］Ve T, Williams SJ, Catanzariti AM, et al. Structures of the flax-rust effector AvrM reveal insights into the molecular basis of plant-cell entry and effector-triggered immunity［J］. Proc Natl Academy of Sci, 2013, 110（43）：17594-17599.

［66］Wang S, Boevink PC, Welsh L, et al. Delivery of cytoplasmic and apoplastic effectors from Phytophthora infestans haustoria by distinct secretion pathways［J］. New Phytol, 2017, 216（1）：205-215.

［67］Dou D, Kale SD, Wang X, et al. RXLR-mediated entry of Phytophthora sojae effector Avr1b into soybean cells does not require pathogen-encoded machinery［J］. Plant Cell, 2008, 20（7）：1930-1947.

［68］Vleeshouwers VG, Oliver RP. Effectors as tools in disease resistance breeding against biotrophic, hemibiotrophic, and necrotrophic plant pathogens［J］. Mol Plant Microbe Interact,2014, 27（3）：196-206.