范素素 田芳 何晨陽

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京100193）

植物病原細菌利用高度保守的III型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）向寄主細胞中直接分泌效應子蛋白（Effector），抑制或破壞寄主免疫系統(tǒng)，或誘導感病基因表達，以達到成功侵染和定殖的目的［1-2］。在某些情況下，細菌效應子可與植物抗病蛋白互作，引起寄主細胞過敏反應［3］。因此，T3SS在細菌毒性表達和誘導植物抗病反應方面均具有重要作用。

編碼T3SS裝置的hrp（Hypersensitive response and pathogenicity）基因簇一般由20多個基因組成，分成幾個轉(zhuǎn)錄單元。其中部分基因編碼了T3SS蛋白組份，其它編碼了調(diào)控蛋白、效應子蛋白及其轉(zhuǎn)運蛋白伴侶。植物病原細菌hrp基因的表達是被緊密調(diào)控的，通常在植物胞內(nèi)被誘導表達，而在豐富營養(yǎng)培養(yǎng)基中被抑制表達［1］。

水稻白葉枯病是世界水稻產(chǎn)區(qū)最重要的細菌病害之一［4］。水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo）通過水稻葉緣水孔或傷口進入胞內(nèi)，定殖木質(zhì)部，產(chǎn)生胞外多糖（EPS），分泌胞外水解酶（如纖維素酶和木聚糖酶），導致病癥產(chǎn)生［4］。此外，T3SS是關鍵致病因子之一，由9個hrp基因（hrpB1、hrpB2、hrpB4、hrpB5、hrpB7、hrpD5、hrpD6、hrpE和hrpF）、9個hrc基 因（hrcC、hrcJ、hrcN、hrcQ、hrcR、hrcS、hrcT、hrcU和hrcV）和8個hpa（hpa1、hpa2、hpa3、hpa4、hpaA、hpaB、hpaF和hpaP）基因組成［5-7］，其表達調(diào)控途徑比較復雜［8］。

對T3SS基因表達及其調(diào)控網(wǎng)絡的解析，對于闡明病原細菌的致病分子機制具有重要的科學理論意義。同時，目前可有效防治水稻細菌病害的農(nóng)藥種類較少，而hrp基因表達調(diào)控途徑的相關蛋白可能是新藥研發(fā)的新分子靶標［9-10］。因此，本文將結合本實驗室的研究結果，綜述Xoo的T3SS表達調(diào)控及其致病機理的研究進展，以期為水稻細菌病害發(fā)生機理的解析及其有效防控措施的研發(fā)提供一些新見解、思路和途徑。

1 hrp基因的誘導性表達

植物病原細菌hrp基因表達具有侵染特異性，在豐富營養(yǎng)培養(yǎng)基中表達受到抑制，但在特定的模擬植物體內(nèi)環(huán)境的低pH貧瘠營養(yǎng)培養(yǎng)基中可被誘導。hrp誘導培養(yǎng)基己被有效地用于病原細菌基因表達調(diào)控和效應子分泌機制等研究中［11］。XOM2是Xoohrp基因誘導培養(yǎng)基，其中碳源是基因表達誘導的重要因素之一；在測試的葡萄糖、蔗糖和果糖等碳源中，木糖對T3SS表達誘導效果最好［12-13］。由于水稻細胞壁富含木聚糖，不能分泌木聚糖酶的Xoo突變體喪失了致病性［14-15］。Xoo中與木糖利用有關的磷酸葡萄糖異構酶缺失突變體的致病性也下降，并且影響其在植物體內(nèi)的生長［16］。因此，木糖可能不僅是Xoo在水稻內(nèi)生長所需的關鍵糖源，也是hrp基因表達的主要誘導因子之一。

2 HrpG和HrpX是hrp基因表達的關鍵調(diào)控因子

根據(jù)hrp基因簇調(diào)控系統(tǒng)、基因相似性及操縱元結構，可將病原細菌hrp基因簇分為兩類：丁香假單胞、胡蘿卜軟腐病菌和歐文氏菌屬于第一類；黃單胞和青枯病菌屬于第二類［1，17］。丁香假單胞3個關鍵蛋白HrpR、HrpS和HrpL調(diào)控了hrp基因表達［18］。HrpR/HrpS與σ54增強子結合蛋白同源，通過激活σ因子HrpL，進而激活其它hrp基因的表達［19-20］。HrpL可以活化啟動子中含有hrp框（CGAACCNA-N14-CCACNNA）的基因［1］。蛋白酶Lon通過調(diào)控HrpR的降解、負向調(diào)控了T3SS的表達［21］。然而，HrpR/HrpS上游的調(diào)控路徑至今仍尚不清楚。

黃單胞HrpG和HrpX是兩個關鍵調(diào)控蛋白，hrpG和hrpX與hrp基因簇在基因組上的位置相距較遠。HrpG屬于OmpR家族雙組分信號系統(tǒng)（TCS），在細菌對外界環(huán)境刺激感應中具有重要作用，同時調(diào)控了hrpX和hrpA（hrcC）的表達［22］。HrpG磷酸化是激活hrp基因表達的關鍵過程，但將磷酸基團轉(zhuǎn)移至HrpG的組氨酸激酶（HK）至今尚未鑒定出來。HrpX屬于AraC調(diào)控蛋白家族成員，對于hrp基因簇5個操縱元（hrpB、hrpC、hrpD、hrpE和hrpF）表達必不可少，而這些操縱元編碼了T3SS裝置所需的蛋白產(chǎn)物［6，23］。

2.1 HrpX調(diào)控hrp基因啟動子順式作用元件

受HrpX調(diào)控的基因啟動子區(qū)通常是一個包含PIP-box的保守序列（TTCGB-N15-TTCGB；B：C、G或T），作為順式作用元件控制基因表達［23-24］。對啟動子區(qū)同源性進行分析，發(fā)現(xiàn)與RNA聚合酶σ70因子的-10結合元件類似的另外一個保守序列（YANNRT：Y，C/T；N，A/T/G/C；R，A/G，稱為-10 box），位于 PIP box下游 30-31bp 位置［24］。在 HrpX調(diào)控的hrp基因操縱元（hrpB、hrpC、hrpD和hrpE）和hpa1啟動子中均存在典型的PIP-box序列。通過尋找細菌基因組中PIP box，新鑒定了一批受HrpX調(diào)控的候選基因［24-25］。

受HrpX調(diào)控的hrpF啟動子區(qū)有一個非典型的PIP-box（TTCGC-N8-TTCGC） 能 被 HrpX 結 合［26］。Xoo中編碼半胱氨酸蛋白酶的cysP2和編碼酮戊二酸轉(zhuǎn)運蛋白的kgtP基因，其啟動子區(qū)域分別含有序列TTCGC-N12-TTCGC和TTCGA-N21-TTCGC，也受到HrpX的調(diào)控［27］。表明PIP-box序列多變，在Xoo中可能還存在其它更多受HrpX調(diào)控的基因。

2.2 HrpX調(diào)控效應子基因

Xoo效應子蛋白分為轉(zhuǎn)錄激活因子類（TAL）和非轉(zhuǎn)錄激活因子類（non-TAL）。TAL效應子具有一個34氨基酸的中央重復區(qū)域、核定位信號和C端轉(zhuǎn)錄激活結構域；轉(zhuǎn)錄激活結構域作用于植物細胞，激活靶基因表達，從而提高植物感病性［28］。黃單胞TAL效應子較為保守，在Xoo 中可多達26個。由于TAL效應子基因無PIP-box和-10 box，其表達并不受HrpX調(diào)控。

與TAL效應子不同，non-TAL效應子不具有結構上的相似性，但在其N端氨基酸組成上具有共同特征。大多數(shù)Xoo non-TAL效應子具有以下特征中的3個：（1）多于20%的Ser和Pro殘基；（2）前50個氨基酸中Leu殘基的比例少于6%；（3）在前12個氨基酸中沒有或僅有一個酸性氨基酸殘基（Asp或Glu）；（4）第3或第4個氨基酸殘基是Leu，Ile，Val或Pro。已經(jīng)從MAFF311018菌株中鑒定了20個non-TAL效應子。盡管一些基因啟動子區(qū)不存在PIP-box或-10 box，但已證實其中至少有17個受到HrpX 調(diào)控［2］。

2.3 HrpX調(diào)控其它功能基因

在II型分泌系統(tǒng)（T2SS）裝置缺失突變體中，許多HrpX依賴的分泌蛋白缺失或分泌量下降。通過N末端氨基酸分析，鑒定出一個T2SS分泌蛋白——半胱氨酸蛋白酶CysP2。cysP2啟動子區(qū)有一個不典型的PIP-box，依賴于HrpX表達。因此，HrpX調(diào)控一些T2SS分泌蛋白編碼基因的表達。

總之，在Xoo基因組中具有典型或非典型PIP-box和-10 box的基因分布比較分散，其中一部分的確受HrpX轉(zhuǎn)錄調(diào)控［25，27］。目前還不清楚這類基因被HrpX調(diào)控的機制，推測有可能通過尚未鑒定、受HrpX調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活子而實現(xiàn)的。另外，大多數(shù)受HrpX調(diào)控基因的功能至今也尚不明了。

3 hrp基因表達的調(diào)控網(wǎng)絡

3.1 雙組分調(diào)控因子

3.1.1 RpfC/RpfG 甘藍黑腐病菌（X. campestrispv.campestris）TCS RpfC/RpfG對于致病性具有關鍵作用［29］。該TCS通過感應胞間可擴散性因子（DSF）信號分子，調(diào)節(jié)胞外酶、生物膜形成和運動性等毒性表型［30］。RpfG含有HD-GYP結構域，控制第二信使c-di-GMP的水解，從而調(diào)節(jié)毒性基因的表達等胞內(nèi)過程［31］。c-di-GMP負向調(diào)控全局轉(zhuǎn)錄激活因子Clp表達，Clp通過2個受其調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子FhrR和 Zur控制hrp基因表達［32-33］。Xoo的 RpfC/RpfG和Clp也影響了hrp基因的表達［34-36］。

3.1.2 PhoP/PhoQ Xoo的PhoP/PhoQ通過調(diào)控hrpG的表達以應答低Ca2+濃度的環(huán)境條件。在低Ca2+濃度下，PhoP/PhoQ缺失突變導致hrpG和其它hrp基因表達下降，從而抑制細菌的毒性［37］。PhoP/PhoQ表達也受另一對TCS RaxR/RaxH負向調(diào)控，后者需要群體感應信號Ax21［38-39］。PhoP/PhoQ同時還應答低Mg2+濃度的環(huán)境條件，調(diào)控其它基因表達，包括corA1、groEL和dnaK，推測它們可能與Mg2+轉(zhuǎn)運蛋白、蛋白折疊、細胞增殖/生存和自我調(diào)節(jié)有關。PhoP/PhoQ是Xoo抵抗抗菌肽和耐酸性環(huán)境所必須的，對于細菌的生存和致病性具有關鍵作用［37］。

3.1.3 ColR/ColS 在雙組分信號系統(tǒng)ColR/ColS缺失突變體中，hrpC和hrpE操縱元表達下降，但hrpG和hrpX表達量接近野生型水平。這使TCS與細菌生長、毒性、過敏反應及抗逆性有關［40］。

3.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Trh

hrpG基因轉(zhuǎn)錄激活是hrp基因表達的關鍵因素之一。Trh是已鑒定的hrpG激活子之一［41］。Trh屬于GntR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，其N末端有保守的DNA結合結構域，C末端有配體結合結構域。GntR蛋白通常作為基因表達的阻遏蛋白發(fā)揮功能，而Trh可能間接地正向調(diào)控hrpG基因的表達。但Trh的直接靶標以及其C末端結合分子尚未鑒定出來。

3.3 DNA/RNA結合蛋白

3.3.1 H-NS蛋白 組蛋白類核結構（H-NS）蛋白是小的DNA結合蛋白，其在革蘭氏陰性菌中高度保守［42-43］。這類蛋白是重要的全局調(diào)控因子，通常起轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白的作用，調(diào)控毒性和環(huán)境信號響應基因的表達。Xoo有3個H-NS蛋白，其中XrvA激活hrpG基因表達［44］，而XrvB阻遏hrpG基因表達，從而抑制了其它hrp基因表達［45］，XrvC在Xoo侵染水稻過程中也調(diào)控其毒性［46］。

3.3.2 RsmA RNA結合蛋白RsmA作為一個全局轉(zhuǎn)錄后修飾因子發(fā)揮作用，影響hrp基因表達［47］。該基因缺失降低了hrpA至hrpF操縱元表達，并且不依賴于HrpG和HrpX。RsmA（Xoo）還影響細菌毒性以及DSF的產(chǎn)生［48］。

3.4 糖代謝途徑

由于hrp基因表達依賴于糖源，在糖代謝與hrp基因調(diào)控間可能關聯(lián)。Xoo依賴木糖［13］，而細菌性條斑病菌（Xoc）則依賴蔗糖和果糖［11］。Xoo可能通過木糖抑制HrpX表達后的裂解，從而增加受HrpX調(diào)控的其它hrp基因的表達［49］。果糖二磷酸醛酸酶（FbaB）催化果糖-1，6-二磷酸與二羥基丙酮和甘油醛-3-磷酸鹽間的可逆轉(zhuǎn)換，對于糖水解和合成具有重要作用。FbaB除影響糖代謝外，還調(diào)控EPS產(chǎn)生、毒性及hrp基因表達［50］。與野生型相比，F(xiàn)baB缺失突變體在水稻上的毒性降低、生長緩慢，在果糖、丙酮酸鹽或蘋果酸鹽作為唯一碳源的培養(yǎng)基中EPS產(chǎn)量減少。同時，F(xiàn)baB缺失后，hrpG和hrpX表達也受到抑制。有些hrp基因（hrcC、hrpE和hpa3）在FbaB突變體中表達量卻上升。此外，F(xiàn)baB本身也受到 HrpG和 HrpX的調(diào)控［47］。GamR是LysR類的半乳糖代謝調(diào)節(jié)因子，通過轉(zhuǎn)錄激活HrpG和HrpX；從而影響Xoo其它hrp基因的表達［51］。

3.5 c-di-GMP調(diào)控途徑

環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）是在革蘭氏陰性細菌中廣泛存在的第二信使，參與調(diào)控細菌毒性、環(huán)境適應性、生物膜形成和運動性等［52-54］。雙組分系統(tǒng)PdeK/PdeR調(diào)控了c-di-GMP的降解，正向調(diào)控了hrp基因表達，同時影響了EPS的產(chǎn)生和毒性［55］。VieA具有保守的c-di-GMP降解酶結構域，盡管其降解酶活性尚未被證實，但其對hrp表達具有正向調(diào)控作用［56］。GdpX1具有保守的c-di-GMP合成酶GGDEF結構域，對hrp基因表達具有負向調(diào)控作用［57］。應答調(diào)控因子PXO_02944的GGDEF/EAL結構域發(fā)生了突變，負向調(diào)控了hrpG基因的轉(zhuǎn)錄，抑制了病菌致病性［58］。

圖1 水稻白葉枯病菌T3SS表達的調(diào)控網(wǎng)絡模型（參考Tsuge等［8］，略有修改）

PilZ結構域蛋白是c-di-GMP的一類受體蛋白。Xoo有3個PilZ結構域蛋白，其中PXO_00049和PXO_02374均可作為受體與c-di-GMP分子發(fā)生結合，并對hrp基因表達具有負向調(diào)控作用［59］。Filp是一個退化的GGDEF/EAL結構域蛋白，可作為受體與c-di-GMP結合；同時它與另一個PilZ結構域蛋白PXO_02715發(fā)生互作，共同對hrp基因表達進行正向調(diào)控［60］。

4 結語

自鑒定出HrpG和HrpX這兩個關鍵調(diào)控因子以來，過去20年的研究已經(jīng)初步構畫出了Xoohrp基因表達的復雜調(diào)控網(wǎng)絡（圖1）。HrpG和HrpX不僅調(diào)控了hrp和效應子基因的表達，也調(diào)控其它毒性相關基因的表達。作為推測的TCS，HrpG磷酸化需要的組氨酸激酶是hrp基因表達的一個關鍵因素，但至今對該組氨酸激酶以及環(huán)境信號一無所知。Xoo存在通過TCS進行細胞密度相關的hrp基因表達的調(diào)控方式，如PhoP/PhoQ、RaxR/RaxH、RpfC/RpfG等。細胞密度感應開關可能是hrp基因表達的另一個關鍵調(diào)控因素。對于hrp基因表達的最初環(huán)節(jié)需要進一步的研究。此外，hrp基因級聯(lián)調(diào)控可能與其它基因調(diào)控途徑偶聯(lián)，包括糖代謝和c-di-GMP信號途徑等。這一復雜精細的調(diào)控網(wǎng)絡調(diào)控了多個基因有序時空表達，從而幫助Xoo通過T3SS裝置，將大量毒性效應子蛋白分泌到水稻細胞內(nèi)，破壞寄主免疫系統(tǒng)，誘導感病基因表達，從而達到成功侵染、并在水稻寄主體內(nèi)定殖的目的。

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