張斌斌，高全文，李 冰，黃 沙

骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)是TGF-β超家族的成員，是一種分泌性多功能蛋白，這些信號蛋白有多種功能，在胚胎發(fā)生、器官形成、細胞增殖和干細胞分化方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。迄今為止，人們所鑒定的BMP至少有20種，如BMP-7與肝臟、眼睛、四肢的發(fā)育有關(guān)；BMP-4、BMP-7及BMP-15對再生組織的發(fā)育很重要；BMP-2、BMP-3及BMP-7有助于軟骨再生；BMP-12及BMP-13與肌腱愈合有關(guān)[3]。BMP在骨形成、骨發(fā)育和間充質(zhì)干細胞分化中也發(fā)揮著重要的作用[4-5]。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，是一類具有自我復(fù)制和多分化能力的成體干細胞，它們可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、成脂細胞、心肌和皮膚等，這些多能干細胞向成骨細胞的分化取決于包括BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在內(nèi)的多條信號通路。研究者通過多種基因敲除模型證明BMP信號通路中斷會造成骨及骨外組織發(fā)育的異常，并闡明了與此相關(guān)的機制[6-9]。目前已經(jīng)證實MSCs在細胞因子(如BMP、bFGF等)、機械力學(xué)刺激、特定化學(xué)物質(zhì)(地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉)等體外環(huán)境刺激下具有明顯的成骨細胞分化能力[10]。改變促進成骨細胞分化的體外環(huán)境能否縮短骨形成的時間(如BMP和機械力在促進骨形成方面是否具有協(xié)同作用)是目前研究的熱點方向之一。筆者所在團隊也在做相關(guān)研究工作。本文通過概括目前BMP調(diào)節(jié)成骨的研究進展，全面展現(xiàn)BMP在骨形成中的作用機制，為修復(fù)骨缺損及發(fā)育異常提供理論依據(jù)。

1 MSC成骨分化過程

骨重建過程主要是由成骨細胞所介導(dǎo)，間充質(zhì)干細胞向成骨細胞譜系增值和分化的過程中需要經(jīng)歷幾個階段的成熟過程，包括：(1)MSC起初形成骨-軟骨原細胞(osteochondral progenitor)[表達Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)和膠原蛋白Ⅱ型]；(2)骨-軟骨原細胞定向為骨原細胞(osteoprogenitor)(表達osterix)；(3)骨原細胞的擴增；(4)成骨細胞(osteoblasts)的成熟(表達骨鈣素和膠原蛋白Ⅰ)；(5)骨細胞的凋亡[11]。這個過程由生長因子、激素、細胞因子、機械負荷和年齡等因素調(diào)節(jié)。MSC向成骨細胞分化是一個多重步驟的過程，該過程需要譜系特異性的轉(zhuǎn)錄因子如Runx2和Osterix(Osx)以及普遍表達的轉(zhuǎn)錄因子Atf4和Dlx5等的參與。Runx2、Osterix/Sp7、β-catenin、轉(zhuǎn)錄激活因子4、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白 1、Smads 等，它們彼此協(xié)同作用，共同參與調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成。其中，核心結(jié)合因子α1/Runx2(core binding factorα1/Runx2，Cbfα1/Runx2)及Osterix/Sp7作為成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細胞分化及骨形成過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用[12]。因而，Runx2及Osterix 也被認為是成骨分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點，參與組成該網(wǎng)絡(luò)的各條信號通路都直接或間接作用于該節(jié)點， 并最終調(diào)控其下游靶基因的表達，從而調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成[13]。

分化后期，成骨細胞需要經(jīng)歷細胞增殖期(包括骨原細胞的增殖)，可以增加細胞數(shù)量，從而形成多層細胞。成骨細胞的增殖過程受多種生長因子調(diào)控，包括BMP、TGFβ、Wnt、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)以及胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，ILGF)[14]；隨后是細胞外基質(zhì)成熟期，細胞開始分化而表達成骨細胞特異的指標蛋白，包括Osx、Ⅰ型膠原酶(TypeⅠCollagen ，Col1)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨粘連蛋白(osteonectin，ON)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)。ALP是鈣和磷形成沉淀的中心，是細胞外基質(zhì)成熟的早期標志。在細胞外基質(zhì)成熟期，成熟的骨細胞合成并分泌Ⅰ型膠原。在礦化期，ALP活性下降，與基質(zhì)中經(jīng)磷灰石沉積相關(guān)的基因表達增加，骨鈣素等非膠原蛋白分泌至細胞外基質(zhì)中，與鈣、磷結(jié)合，然后沿膠原分子的長軸形成羥磷灰石結(jié)晶。最后成骨細胞開始凋亡。

2 BMP和骨形成

盡管BMP介導(dǎo)骨形成的具體分子機制尚有待明確，但已有研究均表明其在成骨分化中起著至關(guān)重要的作用。多數(shù)學(xué)者認為 BMPs是骨形態(tài)發(fā)生最早期的信號分子，對成骨細胞分化及骨形成具有特異性誘導(dǎo)作用[15-16]。動物研究發(fā)現(xiàn)腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒和重組體等介導(dǎo)BMP過表達可誘導(dǎo)骨形成。BMP轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞可使成骨細胞特異性標記物表達增加，包括早期成骨標記物堿性磷酸酶(ALP)、晚期成骨標記物骨鈣素和骨調(diào)素、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、DNA結(jié)合物抑制劑(ID)和Cbfa1/Runx2[3]。在脊椎動物中，骨形成通過膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩種方式完成，這兩種方式都由BMP直接介導(dǎo)完成，其中，BMP-2和BMP-4在骨形成過程中對間充質(zhì)細胞的分化起著至關(guān)重要的作用[16]。

最早研究的BMP家族成員是BMP-2和BMP-7。腺病毒介導(dǎo)BMP-2體外轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞，使其成骨活性增加，表明BMP-2在成骨細胞分化方面有作用[17-18]。Ad-BMP-2在C3H10T1/2細胞中過表達后，ALP活性、礦化程度及骨特異性蛋白(Ⅰ型膠原、骨調(diào)素和骨鈣素)mRNA的表達都增高[17]。Partridge等[18]將Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染的骨髓骨原細胞植入生物降解高分子支架中，通過檢測發(fā)現(xiàn)ALP活性、Ⅰ型膠原形成及礦化程度均增加。Ishikawa等[19]體外培養(yǎng)BMSCs過程中給予rhBMP-2干預(yù)，細胞增殖能力增強，同時在傳代過程中仍保持成骨分化能力。BMP-7也有誘導(dǎo)成骨的能力。Franceschi等[20]通過檢測ALP活性和基質(zhì)礦化程度發(fā)現(xiàn)Ad-BMP-7轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞和肌源祖細胞可分化為成骨細胞，最終形成骨。

雖然BMP-2和BMP-7是最早被人鑒定出具有誘導(dǎo)成骨能力的骨形成蛋白，但它們的成骨能力在BMPs中是否最強尚未知曉。隨后研究又發(fā)現(xiàn)了BMP-4、BMP-6及BMP-9等。Kang等[4]通過重組腺病毒AdEasy系統(tǒng)介導(dǎo)的方法，成功構(gòu)建了Ad-BMP-2到Ad-BMP-15等14種腺病毒，轉(zhuǎn)染C2C12細胞后結(jié)果顯示出BMP-2、BMP-6、BMP-7及BMP-9均能在體內(nèi)誘導(dǎo)骨形成。

研究發(fā)現(xiàn)BMP-6在體內(nèi)外有成骨潛能。Zachos等[21]將Ad-BMP-6導(dǎo)入馬BMSCs中發(fā)現(xiàn)成骨細胞的ALP活性、基質(zhì)礦化能力及成骨標記物基因的表達增加。Valdes等[22]進行兔動物實驗，發(fā)現(xiàn)重組人BMP-6蛋白質(zhì)能促進兔骨髓骨原細胞的成骨能力。

Aslan等[23]利用電穿孔技術(shù)將BMP-9 轉(zhuǎn)染到人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)中，4周后可觀察到骨組織形成，可見BMP-9是一種強有力的骨形成誘導(dǎo)因子。Kimelman-Bleich等[24]通過建立小鼠的骨不連模型，明膠海綿填充骨缺損處，10d后利用BMP-9治療，可在骨缺損處形成骨橋并修復(fù)骨不連。

筆者對面中部牽引的骨縫進行組織學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在牽引和固定過程中，骨縫寬度逐漸增大，骨縫中出現(xiàn)大量新生血管，骨縫重新進行改建，形成新的骨縫。同時發(fā)現(xiàn)，在牽張期，BMP-2表達明顯增加，在固定期，BMP-2表達逐漸減少[25]。Liu等[26]將基因重組BMP-2與膠原膜復(fù)合后覆蓋于受擴張力作用下的頂骨矢狀縫上方，可以增強受擴張力作用后頂骨矢狀縫組織的成骨作用。Yao等[27]應(yīng)用緩釋技術(shù)將BMP-2注射到骨縫牽引區(qū)域，骨縫新骨形成加快，骨密度增加。Ashinoff等[28]將攜帶BMP-2基因的腺病毒注射至切骨牽引骨痂中，經(jīng)X線、組織學(xué)及骨組織量學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該方法可以加速切骨牽引骨痂新骨形成的速度和質(zhì)量。筆者目前正在進行BMP-2與機械力是否可以協(xié)同促進骨縫成骨的相關(guān)研究。

3 經(jīng)典的BMP信號通路

3.1BMP信號通路中的BMP配體、BMPⅠ型和Ⅱ型受體 TGF-β家族通常有兩種不同的受體蛋白，稱之為Ⅰ型和Ⅱ型受體。在哺乳動物中Ⅰ型受體包括7種：ALK1、ALK2/ACTRⅠA、ALK3/BMPRⅠA、ALK4/ACTRⅠB、ALK5/TβR1、ALK6/BMPRⅠB、ALK7，而Ⅱ型受體則包含5種：TβRⅡ、ACTRⅡA、ACTRⅡB、BMPRⅡ、AMHRⅡ。目前認為其中只有ALK1、ALK2/ACTRⅠA、ALK3/BMPRⅠA、ALK6/BMPRⅠB、ACTRⅡA、ACTRⅡB和BMPRⅡ可以作為BMP家族的受體[29]。

BMPⅠ型和Ⅱ型受體都是以異二聚體形式存在的跨膜蘇氨酸-絲氨酸激酶受體。所有的受體都包括一個位于細胞膜外N末端的配體結(jié)合域、一個跨膜區(qū)域和一個位于細胞膜內(nèi)的含絲/蘇氨酸激酶的C末端三部分。細胞外配體-受體結(jié)合后，信號通路被啟動。BMP首先與BMPⅡ型受體結(jié)合，Ⅱ型受體細胞內(nèi)的活性激酶區(qū)通過磷酸化Ⅰ型受體的GS區(qū)域(Ⅰ型受體細胞內(nèi)特征性的高度保守的TTSGSGSG序列[2])，隨后磷酸化的BMPⅠ型受體再進一步磷酸化Smads蛋白，最終使細胞內(nèi)Smad(Sma-Mad)等蛋白磷酸化來完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[30](圖1)，繼而啟動并激活成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(如 Cbfα1/Runx2、Osterix/Sp7 等)，從而誘導(dǎo)MSCs 向成骨細胞分化及骨形成。

圖1 BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖。BMP配體與BMPⅡ型受體結(jié)合，導(dǎo)致BMPⅠ型受體磷酸化，后者趨化R-Smads (Smads 1/5/8)到BMPⅠ型受體周圍，激活R-Smads。活化的R-Smads與Co-Smads (Smad 4)形成異聚復(fù)合體，進入細胞核，調(diào)節(jié)基因表達。抑制型Smads(Smads 6/7)從細胞核移出，通過抑制通路上的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負性調(diào)節(jié)BMP信號通路

3.2BMP-Smad信號通路調(diào)節(jié)骨再生 BMP與受體結(jié)合后會激活Smad依賴型和Smad非依賴型兩條信號通路中的一條。為了更好的地理解BMP在骨形成中的作用，筆者在此主要探討Smad依賴型信號通路。Smads蛋白家族是細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，由Mad以及Sma兩個相關(guān)等位基因編碼，目前發(fā)現(xiàn)有9個亞型，即Smad1-9[31]。包括3種類型：受體調(diào)節(jié)型Smad(R-Smad)、共同介質(zhì)型Smad(Co-Smad)、抑制型Smad(I-Smad)。每一種Smad蛋白對BMP的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都很重要?；罨腎型受體直接與R-Smads作用，而Co-Smads與活化的R-Smads形成復(fù)合物共同轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。抑制型Smads(I-Smads)通過抑制信號通路的幾個位點對信號通路發(fā)揮負調(diào)控作用。

R-Smad蛋白(Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad9，其中Smad1、Smad5和Smad8與BMP-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān))C端功能域末端含有絲氨酸-絲氨酸-任意氨基酸-絲氨酸(Ser-Ser-X-Ser，SSXS)保守序列，沿著該序列，R-Smads在氨基端(N端)和羧基端(C端)末尾有兩個同源區(qū)域：MH1區(qū)和MH2區(qū)，這兩個區(qū)對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都很重要[2]。MH1區(qū)直接與DNA序列結(jié)合，而MH2與BMPⅠ型受體結(jié)合。此外，MH2區(qū)也可以與其他的Smads結(jié)合形成聚合體，在轉(zhuǎn)錄激活方面發(fā)揮作用[3]。一經(jīng)激活，磷酸化的R-Smad就會脫離BMPⅠ型受體，與Smad4形成復(fù)合體。Smad 4是哺乳動物中唯一的Co-Smad，存在于所有的BMP信號通路。R-Smad/Co-Smad異二聚體復(fù)合物在細胞核中與各種轉(zhuǎn)錄因子、共激活劑和共抑制劑共同調(diào)節(jié)基因表達。

I-Smads包括Smad6和Smad7，對BMP信號通路發(fā)揮負性調(diào)控作用。這些I-Smads通常位于細胞核內(nèi)，經(jīng)BMP活化后移向細胞質(zhì)和細胞膜，在BMP信號通路的多個位點上抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]。Smad7與活化的BMPⅠ型受體結(jié)合阻止R-Smads被活化。Smad7也可與E3泛素連接酶蛋白、Smurf1和Smurf2發(fā)生作用，促進BMP受體降解。Smad 6發(fā)揮作用不同于Smad7,主要與Smad4競爭結(jié)合R-Smads來阻止R-Smad/Co-Smad異二聚體復(fù)合物形成，從而產(chǎn)生負性調(diào)節(jié)作用[3]。

4 MSC成骨分化BMP信號通路的調(diào)控

分子遺傳學(xué)研究表明，內(nèi)源性或外源性BMPs通過結(jié)合細胞膜上特異性受體BMP 受體Ⅰ及BMPR-Ⅱ，使 BMPR-Ⅰ磷酸化，再與BMPs特異作用的Smads蛋白(如 Smad1、5、8)結(jié)合并使其也發(fā)生磷酸化，然后進入細胞核，Smad蛋白的磷酸化導(dǎo)致Runx2和Osterix的上調(diào)，這兩個轉(zhuǎn)錄因子是控制成骨發(fā)生過程的關(guān)鍵因子，從而誘導(dǎo)MSCs向成骨細胞分化及骨形成[32]。BMP信號通路受到廣泛的多層次調(diào)控，以確保其和一些特定的下游反應(yīng)在適當(dāng)?shù)臅r空被激活。BMP基因調(diào)控已受到越來越多的關(guān)注，主要有細胞外調(diào)控、膜調(diào)控、細胞內(nèi)調(diào)控。細胞外可以受到BMP蛋白受體激動劑、BMP蛋白拮抗劑以及細胞外基質(zhì)成分的調(diào)節(jié)；細胞膜上可以受到仿真受體或BMP共受體(如RGMs)的調(diào)控；而在細胞內(nèi)的調(diào)控就相對復(fù)雜，可以受DNA結(jié)合蛋白、R-Smad/Co-Smad轉(zhuǎn)錄的共激活劑和共抑制劑、抑制性Smads(Smad6和Smad7)和其他調(diào)控配體蛋白、MicroRNAs調(diào)控以及與其他信號通路的交叉調(diào)控[33]。

5 MSC成骨分化其他通路的調(diào)控

5.1Wnts信號通路 Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌方式與位于細胞膜上的Frizzled蛋白和共同受體(LRP5/ LRP5)相結(jié)合，將信號傳導(dǎo)至細胞質(zhì)中，細胞質(zhì)中的β-Catenin轉(zhuǎn)運到細胞核，和轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF蛋白通過經(jīng)典的Wnt/β-Catenin信號通路調(diào)節(jié)靶基因的表達，進而促進骨的形成[34-35]，與BMP-Smads信號通路類似，經(jīng)典Wnt信號通路在調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成方面最終也是通過作用于Runx2 起作用,但其分子機制還不是很明確。

5.2FGFs信號通路 在成骨細胞中，F(xiàn)GFs信號通過一組高親和力的有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的跨膜受體(FGFR1、FGFR4)激活MAPK信號通路。這些生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果會引起Runx2和/或Osterix的激活。在成骨細胞中，F(xiàn)GFR2和其受體之間的相互作用使受體發(fā)生二聚化和自身磷酸化，反過來又激活p42/43 MAPK和蛋白激酶C(PKC)。PKC的激活促進Runx2轉(zhuǎn)錄的增加，而磷酸化和激活的p42/43 MAPK則促進Runx2蛋白的磷酸化和激活進而引起成骨細胞特異性基因，如堿性磷酸化和骨鈣蛋白表達的增加，引起骨形成的增加[36-37]。

5.3IGF1/ET1信號通路 胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors 1，IGF1)和內(nèi)皮素-1(endothelin 1,ET1)分別結(jié)合到受體酪氨酸激酶受體IGF1R和G-蛋白偶聯(lián)受體ETA上，激活MAPK信號通路進而調(diào)節(jié)成骨細胞的分化。

5.4Notch信號通路 Notch信號通路主要成員包括Notch受體、配體、CSL蛋白以及Notch信號的效應(yīng)分子。當(dāng)Notch受體與相鄰細胞表面的配體結(jié)合后，Notch信號通路即被激活，此時Notch受體分別在TACE及γ-分泌酶的作用下相繼發(fā)生兩次蛋白水解，釋放出Notch受體胞內(nèi)活性片段 (Notch intracellular domain，NICD)，并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)與CSL蛋白(一種DNA 結(jié)合蛋白)及其共活化因子MAML結(jié)合，從而啟動并激活其下游靶基因(如 HES、HEY等)的表達[38]。 目前，Notch 信號通路在調(diào)節(jié)MSCs 向成骨細胞分化過程中的重要作用，已在多種體內(nèi)外模型中得到印證[39-40]。此外Notch信號通路還參與調(diào)節(jié)BMP及Wnt信號誘導(dǎo)的成骨細胞分化及骨形成。Notch信號通路可通過多種途徑直接或間接地參與調(diào)控成骨細胞分化及骨形成。

5.5Hedgehog信號通路 Hedgehog蛋白是一類分泌型信號蛋白，主要包括3種同源蛋白，即Indian hedgehog(Ihh)、Sonic hedgehog(Shh)及 Desert hedgehog(Dhh)。與其他信號通路類似，Hedgehog 信號通路也是由Hedgehog相應(yīng)配體(Ihh、Shh、 Dhh)、受體(Patched/Ptc、Smoothened/Smo)及細胞內(nèi)信號分子(Cos2/Kif7、Fu、Ci/Gli)等組成[41]。當(dāng)Hedgehog蛋白在細胞膜上與特殊受體Ptc結(jié)合時，Smo得以活化，活化的Smo與Cos2、Fu結(jié)合形成復(fù)合物，從而啟動下游靶基因(如 Cyclin D/ E、HIP、Myc 等)的表達。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[42]，Hedgehog信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化過程中亦具有十分重要作用。Hedgehog信號通路也可通過間接調(diào)控Runx2的表達來調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成等，因而也被視作調(diào)控成骨細胞分化及骨形成關(guān)鍵信號通路之一，但其具體調(diào)節(jié)機制目前還未完全闡明，仍需進一步研究。

以上信號通路之間存在著一定的聯(lián)系，共同作用從而調(diào)節(jié)成骨的分化，但是大多數(shù)信號通路的確切機制還不明了，各通路之間的相互聯(lián)系研究較少，還需要進一步深入探討。

6 展望

近年來，研究者們運用BMP或者相關(guān)載體介導(dǎo)BMP基因轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs從而誘導(dǎo)其向成骨分化都取得了進步，但也存在一些問題。首先，無論通過生物材料運載BMP或者載體介導(dǎo)BMP基因轉(zhuǎn)染MSCs植入缺損區(qū)域或骨縫區(qū)必然會帶來一系列宿主免疫反應(yīng)，目前并未發(fā)現(xiàn)完全不產(chǎn)生免疫反應(yīng)的載體，因此在誘導(dǎo)成骨時應(yīng)該充分考慮載體選擇問題。其次，各種BMP基因和相關(guān)協(xié)助基因轉(zhuǎn)染進入宿主體內(nèi)，其造成局部BMP或其他因子蓄積過高，存在基因組序列突變的風(fēng)險?，F(xiàn)有研究證明BMP誘導(dǎo)成骨存在多條信號傳導(dǎo)通路，但相關(guān)機制尚不清楚，是否能通過直接激活相關(guān)通路上的某些信號分子激活并調(diào)控成骨，或能否從轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控水平尋找誘導(dǎo)成骨基因治療可能是未來的研究方向。

綜上所述，BMP在誘導(dǎo)MSCs成骨分化方面作用顯著，但仍存在著許多未知問題，需要更深入的探討使其在治療骨缺損及骨發(fā)育異常方面有望展現(xiàn)更好的臨床應(yīng)用前景。

[1] Attisano L，Wrana JL.Signal transduction by the TGF-beta superfamily[J].Science，2002，296(5573):1646-1647.

[2] Shi Y，Massague J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus[J].Cell，2003，113(6):685-700.

[3] Beederman M，Lamplot JD，Guoxin Nan，et al.BMP signaling in mesenchymal stem cell differentiation and bone formation[J].J Biomed Sci Engineering，2013，6(8):32-52.

[4] Kang Q，Sun MH，Cheng H，et al．Characterization of the distinct orthotopic bone-forming activity of 14 BMPs using recombinant adenovirus-mediated gene delivery[J].Gene Ther，2004，11(17):1312-1320．

[5] Luther G，Wagner ER，Zhu G，et al.BMP-9 induced osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells: molecular mechanism and therapeutic potential[J].Curr Gene Ther，2011，11(3)：229-240.

[6] Shu B，Zhang M，Xie R，et al.BMP2，but not BMP4，is crucial for chondrocyte proliferation and maturation during endochondral bone development[J].J Cell Sci，2011，124(Pt 20):3428-3440.

[7] Estrada KD，Retting KN，Chin AM，et al.Smad6 is essential to limit BMP signaling during cartilage development[J].J Bone Miner Res，2011，26(10):2498-2510.

[8] Wang M，Jin H，Tang D，et al.Smad1 plays an essential role in bone development and postnatal bone formation[J].Osteoarthritis Cartilage，2011，19(6):751-762.

[9] Canalis E，Brunet LJ，Parker K，et al.Conditional inactivation of noggin in the postnatal skeleton causes osteopenia[J].Endocrinology，2012，153(4):1616-1626.

[10] Abdallah BM，Haack-Sorensen M，Burns JS，et al.Maintenance of differentiation potential of human bone marrow mesenchymal stem cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene despite[corrected]extensive proliferation [J].Biochem Biophys Res Commun，2005，326(3):527-538.

[11] Harada S，Rodan GA.Control of osteoblast function and regulation of bone mass[J].Nature，2003，423(6937):349-355.

[12] Komori T.Regulation of osteoblast differentiation by transcription factors[J].J Cell Biochem，2006，99(5):1233-1239.

[13] Soltanoff CS，Yang S，Chen W，et al.Signaling networks that control the lineage commitment and diff erentiation of bone cells[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2009，19(1):1-46.

[14] Bonewald LF，Johnson ML.Osteocytes，mechanosensing and Wnt signaling[J].Bone，2008，42(4):606-615.

[15] Chen GQ，Deng CX，Li YP.TGF-β and BMP signaling in osteoblast diff erentiation and bone formation[J].Int J Biol Sci，2012，8(2):272-288.

[16] Walsh DW，Godson C，Brazil DP，et al.Extracellular BMP antagonist regulation in development and disease:tied up in knots[J].Trends Cell Biol,2010，20(5):244-256.

[17] Cheng SL，Lou J，Wright NM，et al.In vitro and in vivo induction of bone formation using a recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene[J].Calcif Tissue Int，2001，68(2):87-94.

[18] Partridge K，Yang X，Clarke NM，et al.Adenoviral BMP-2 gene transfer in mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo bone formation on biodegradable polymer scaffolds[J].Biochem Biophys Res Commun，2002，292(1):144-152.

[19] Ishikawa H，Kitoh H，Sugiura F，et al.The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on the osteogenic potential of rat mesenchymal stem cells after several passages[J].Acta Orthop，2007，78(2):285-292.

[20] Franceschi RT，Wang D，Krebsbach PH，et al.Gene therapy for bone formation: in vitro and in vivo osteogenic activity of an adenovirus expressing BMP7[J].J Cell Biochem，2000，78(3):476-486.

[21] Zachos TA，Shields KM，Bertone AL.Gene-mediated osteogenic differentiation of stem cells by bone morphogenetic proteins-2 or -6[J].J Orthop Res，2006，24(6):1279-1291.

[22] Valdes M，Moore DC，Palumbo M，et al.rhBMP-6 stimulated osteoprogenitor cells enhance posterolateral spinal fusion in the New Zealand white rabbit[J].Spine J，2007，7(3)：318-325.

[23] Aslan H，Zilberman Y，Arbeli V，et al．Nucleofection-based ex vivo nonviral gene delivery to human stem cells as a platform for tissue regeneration[J].Tissue Eng，2006，12( 4)：877 -889．

[24] Kimelman-Bleich N，Pelled G，Zilberman Y，et al．Targeted gene and host progenitor cell therapy for nonunion bone fracture repair[J].Mol Ther，2011，19(1):53-59．

[25] 金增強，馬驍，柳春明.犬面中份縫牽引成骨過程中骨形成蛋白-2的表達[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，28(12):1356-1359.

[26] Liu SS，Opperman LA，Buschang PH.Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop，2009，136(6):768.e1-8;discussion 768-769.

[27] Yao Y，Wang G，Wang Z，et al.Synergistic enhancement of new bone formation by recombinant human bone morphogenetic protein-2 and osteoprotegerin in trans-sutural distraction osteogenesis: a pilot study in dogs[J].J Oral Maxillofac Surg，2011，69(11):e446-455.

[28] Ashinoff RL，Cetrulo CL Jr，Galiano RD，et al.Bone morphogenic protein-2 gene therapy for mandibular distraction osteogenesis[J].Ann Plast Surg，2004，52(6):585-590; discussion 591.

[29] 趙志偉，趙志杰.BMP及其共受體RGM家族信號通路的研究進展[J].四川解剖學(xué)雜志，2012，20(3)：38-45.

[30] Hill CS．Nucleocytoplasmic shuttling of Smad proteins[J].Cell Res，2009，19(1):36-46．

[31] 於紹龍，劉丹平.成骨因子BMP-2/Smads/Runx2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[J].遼寧醫(yī)學(xué)報學(xué)報，2014,35(5):94-96.

[32] Tachi K，Takami M，Sato H，et al.Enhancement of bone morphogenetic protein-2-induced ectopic bone formation by transforming growth factor-β1[J].Tissue Eng Part A，2010，17(5-6):597-606.

[33] 吳禮楊，貝抗勝.骨形成蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控中國組織工程研究[J].2012 ，16(2):331-335

[34] Monroe DG，McGee-Lawrence ME，Oursler MJ，et al.Update on Wnt signaling in bone cell biology and bone disease[J].Gene，2012，492(1):1-18.

[35] Liu W，Konermann A，Guo T，et al.Canonical Wnt signaling differently modulates osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and from periodontal ligament under inflammatory conditions[J].Biochim Biophys Acta，2014，1840(3):1125-1134.

[36] Marie PJ，Miraoui H，Sévère N.FGF/FGFR signaling in bone formation:progress and perspectives[J].Growth Factors，2012，30(2):117-123.

[37] Fei Y，Xiao L，Doetschman T，et al.Fibroblast growth factor 2 stimulation of osteoblast differentiation and bone formation is mediated by modulation of the Wnt signaling pathway[J].J Biol Chem，2011，286(47):40575-40583.

[38] Mead TJ，Yutzey KE.Notch signaling and the developing skeleton//Notch Signaling in Embryology and Cancer[M].New York:Springer Verlag New York Inc，2012:114-130.

[39] Ugarte F，Ryser M，Thieme S，et al.Notch signaling enhances osteogenic diff erentiation while inhibiting adipogenesis in primary human bone marrow stromal cells[J].Exp Hematol，2009，37(7):867-875.

[40] Zanotti S，Smerdel-Ramoya A，Stadmeyer L，et al.Notch inhibits osteoblast diff erentiation and causes osteopenia[J].Endocrinology，2008，149(8):3890-3899.

[41] Beachy PA，Hymowitz SG，Lazarus RA，et al.Interactions between Hedgehog proteins and their binding partners come into view[J].Genes Dev，2010，24(18):2001-2012.

[42] Fontaine C，Cousin W，Plaisant M，et al.Hedgehog signaling alters adipocyte maturation of human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells，2008，26(4):1037-1046.