聶 海,劉 鵬，曹德乾，白春宏,周 際，劉齊東,安 洪

選擇性腸道去污染(selective decontamination of the digestive tract，SDD)是一種應(yīng)用前景廣闊的預(yù)防感染、降低病死率的經(jīng)濟、有效方法，已在ICU、胃腸、燒傷等科室感染治療中發(fā)揮著一定作用[1-4]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于脊髓損傷患者的報道。筆者已經(jīng)通過動物實驗證實短期口服腸道抗生素選擇性抑制腸道潛在致病菌，防止細菌過度繁殖，可以有效控制脊髓損傷動物腸道細菌移位，但其具體機制尚不清楚。本研究通過探討SDD對急性創(chuàng)傷性截癱家兔小腸組織MDA含量和SOD、GSH-Px活性，明確氧化應(yīng)激損傷在截癱家兔腸屏障功能損害中的作用及意義，為進一步研究截癱后腸道細菌移位和內(nèi)毒素血癥的致傷機制提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 實驗動物與截癱家兔模型的建立

根據(jù)文獻報道建立動物模型[5]。根據(jù)研究目的和精度要求選擇40只體質(zhì)量為2.0～2.5kg 6月齡清潔級健康家兔(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供)，雌雄不限，隨機分為處理組和對照組，每組20只；另外增加正常對照組家兔10只。速眠新Ⅱ(解放軍軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所研制)按0.2mL/kg體重肌肉注射麻醉后，取背部正中切口打開椎板，顯露并完全游離脊髓，從脊髓前方垂直于T6節(jié)段脊髓放入夾持力為98g的中號顯微血管夾夾持脊髓約1min、大腦皮層誘發(fā)電位證實脊髓完全橫斷，即未引導(dǎo)出大腦皮層誘發(fā)電位，僅出現(xiàn)大腦自發(fā)腦電活動。徹底止血后逐層關(guān)閉切口。術(shù)后予以肌注青霉素鈉50萬U，1次/d抗感染，肌注鹽酸哌替啶注射液1mg/kg，1次/d鎮(zhèn)痛處理。專人分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為室溫(20±2)℃、光線良好、環(huán)境安靜，給予普通飼料和清潔飲水，定期導(dǎo)尿預(yù)防膀胱尿潴留。

2 SDD處理方案[6-7]

截癱家兔模型建立后，隨機選擇20只癱瘓家兔灌飼(每8h灌飼1次，共4d)多粘菌素E(P)(重慶桑禾動物藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格：250g/袋)、妥布霉素(T)(太極集團西南藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：80mg/支)和兩性霉素B(A)(華北制藥集團新藥研發(fā)有限公司，規(guī)格：25mg/支)進行消化道選擇性去污染(SDD)處理。SDD方案：在100mL生理鹽水中加入多粘菌素E 50mg，妥布霉素40mg，兩性霉素B 250mg制成混懸液，每次灌飼5mL。對照組灌飼等量生理鹽水。

3 標本的采集和保存

截癱家兔飼養(yǎng)4d后采集小腸組織標本保存或進行相關(guān)檢測。采取腹部正中切口，切開腹部皮膚、皮下及深筋膜組織，進入腹腔，切取距回盲部5cm左右適量小腸組織，用生理鹽水充分沖洗干凈腸內(nèi)容物，稱取重量后，4℃生理鹽水制成10%的組織勻漿，4 000r/min 4℃冷凍離心10min，取上清分裝，-20℃冷凍保存待檢，留取部分上清液檢測組織總蛋白含量;同時切取距回盲部約10cm的小腸組織約1cm，生理鹽水沖洗干凈腸內(nèi)容物，4%多聚甲醛固定。

4 檢測MDA含量和SOD、GSH-Px

將小腸組織制成10%勻漿，考馬斯亮藍法測定組織總蛋白含量，檢測步驟嚴格按照蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

改良硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)比色分析法檢測血漿和腸道組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，檢測步驟嚴格按照MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

黃嘌呤氧化酶法檢測血漿和腸道組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，檢測步驟嚴格按照SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

酶促反應(yīng)谷胱甘肽消耗法檢測血漿和腸道組織谷胱甘肽過氧物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性，操作步驟嚴格按照GSH-Px檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

5 HE染色和圖像分析

將腸組織標本包埋、切片、脫蠟入水后進行HE染色。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。結(jié)果判定：細胞核呈藍色，細胞漿及其他組織呈粉紅色。在光鏡下觀察小腸病理組織學(xué)改變并進行圖像分析。按Chiu六級評分[8]評價小腸黏膜上皮損傷程度(0～5級)，并賦予相應(yīng)的分值(0～5分)。每個動物觀察10個視野進行評分，其評分總和為小腸病理評分。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 小腸組織MDA含量

正常組小腸組織MDA水平為(2.14±0.67)nmoL/mgprot；對照組為(8.19±1.22)nmoL/mgprot；處理組為(3.58±0.98)nmoL/mgprot，多組均數(shù)間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=150.907,P<0.001)。處理組與對照組均數(shù)間比較小腸組織MDA含量明顯降低(P<0.001)，但仍明顯高于正常組小腸組織MDA水平(P<0.001)。見圖1。

圖1 小腸組織MDA含量比較

2 小腸組織SOD活力

正常組小腸組織SOD活性為67.4±5.9U/mgport、對照組為42.7±13.4U/mgport、處理組為57.2±9.4U/mgport，多組均數(shù)間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.737,P<0.001)。處理組與對照組比較小腸組織SOD活力明顯升高(P<0.001)，但仍較正常組小腸組織SOD活力低(P=0.0178)。見圖2。

圖2 小腸組織SOD活力比較

3 小腸組織GSH-Px活力

正常組小腸組織GSH-Px活性為115.6±9.8U/mgport、對照組為89.7±11.0U/mgport、處理組為111.6±12.0U/mgport，組間均數(shù)間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=26.228,P<0.001)。處理組與對照組比較小腸組織GSH-Px活力明顯升高(P<0.001)，而與正常組比較無統(tǒng)計意義(P=0.361)。見圖3。

圖3 小腸組織GSH-Px活力比較

4 小腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)與小腸病理評分之間的關(guān)系

從表1中可以看出，小腸HE染色Chiu病理評分與小腸組織MDA呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，與SOD、GSH-Px呈顯著負相關(guān)(P<0.01)。見表1。

討 論

創(chuàng)傷性癱瘓患者有一半以上出現(xiàn)便秘、大便失禁或阻塞等腸道功能障礙[9]，發(fā)生發(fā)熱、全身炎癥反應(yīng)綜合征( SIRS)、膿毒血癥等感染并發(fā)癥，成為癱瘓患者死亡的主要原因[10-12]，嚴重影響脊髓損傷患者身心健康。因此脊髓損傷后早期采取有效措施預(yù)防控制腸道細菌移位及內(nèi)毒素血癥，對防治腸源性感染(enterogenic infection)、提高患者生存質(zhì)量、降低病死率具有重要的臨床實用價值。SDD已在ICU、燒傷科等危重病患者感染治療中發(fā)揮著一定作用，但目前尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于脊髓損傷患者的報道。筆者的前期研究已經(jīng)證實SDD可以選擇性抑制和消滅截癱家兔腸道潛在致病菌，防止細菌過度繁殖，控制腸道細菌移位。

機體遭受脊髓損傷后產(chǎn)生全身應(yīng)激對抗損傷，這種狀態(tài)持續(xù)將發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。這時機體免疫系統(tǒng)激活、炎癥介質(zhì)釋放、毒素吸收及缺血-再灌注損傷等一系列病理生理變化均可產(chǎn)生大量氧自由基攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷[14]，進一步出現(xiàn)細胞膜結(jié)構(gòu)紊亂，膜結(jié)合酶及受體脂質(zhì)微環(huán)境發(fā)生改變，酶活性、受體功能下降以及DNA損傷，細胞超微結(jié)構(gòu)特別是肌漿網(wǎng)和線粒體功能受損，進而引起生物體各種病理生理變化[15]。生物體在長期的進化過程中，形成了一套抗氧化系統(tǒng)來清除體內(nèi)多余的氧自由基，抗氧化酶主要有SOD、GSH-Px等。SOD能將氧自由基歧化為H2O2，H2O2在GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)的催化下被清除。GSH-Px在細胞漿中直接參與清除H2O2，減少羥自由基的產(chǎn)生，促使體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物分解而減輕其毒性。機體創(chuàng)傷后氧化應(yīng)激是氧化和抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡，表現(xiàn)為自由基的產(chǎn)生增多和(或)機體組織抗氧化能力下降，過度的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致組織損害，機體迅速出現(xiàn)衰竭甚至死亡。因此，氧化應(yīng)激反應(yīng)在創(chuàng)傷后機體的病理生理變化過程中起著重要作用。本研究建立截癱家兔模型并采用SDD處理截癱家兔，檢測不同時相點小腸組織MDA含量和SOD、GSH-Px活性，探討氧化應(yīng)激在脊髓損傷后腸黏膜屏障障礙中的作用及意義，為進一步研究脊髓損傷后腸道功能障礙機制及患者救治提供實驗依據(jù)。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最終代謝產(chǎn)物，在血清和組織中的含量反映了機體脂質(zhì)過氧化的速度和強度；而SOD、GSH-Px是體內(nèi)主要的自由基清除劑，具有保護生物體免受自由基的攻擊，催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，阻斷自由基的毒性作用，保護機體組織和細胞DNA免受氧化損傷。因此，同時檢測MDA含量和SOD、GSH-Px活性可了解自由基產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)的功能狀態(tài)，是反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平的敏感指標。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)SDD處理后的截癱家兔小腸組織內(nèi)MDA含量較未處理的截癱家兔低，而SOD、GSH-Px活性升高，提示家兔截癱后體內(nèi)脂質(zhì)過氧化顯著增強，并維持在較高水平，機體抗脂質(zhì)過氧化系統(tǒng)已不能代償氧化應(yīng)激反應(yīng)，但經(jīng)SDD可改善脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而保護腸黏膜。小腸HE染色Chiu氏病理評分與小腸組織MDA呈顯著正相關(guān)，與SOD、GSH-Px呈顯著負相關(guān)，表明小腸氧化應(yīng)激反應(yīng)與小腸病理學(xué)改變相關(guān)，氧化應(yīng)激參與了脊髓損傷后腸黏膜的破壞過程。

氧化應(yīng)激損傷可能與MDA升高或抗氧化酶降低有關(guān)。過量MDA與氨基酸反應(yīng)和蛋白質(zhì)交聯(lián)而損傷蛋白并降低細胞膜ATPase活性，其細胞毒性作用損傷生物膜，導(dǎo)致細胞損傷甚至死亡；機體SOD、GSH-Px等抗氧化酶急劇減少，不能有效清除脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物，而氧自由基等可損傷內(nèi)皮細胞，增加血管通透性，進一步導(dǎo)致間質(zhì)細胞廣泛損傷，引起臟器功能失常，表明氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡不僅是腹腔臟器損傷的結(jié)果，而且是促進傷情發(fā)展的重要原因之一。

截癱家兔小腸組織MDA含量增加和SOD、GSH-Px活性降低的可能原因：(1)創(chuàng)傷產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，機體應(yīng)激狀態(tài)下交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)激活，腹腔內(nèi)臟血管持續(xù)收縮導(dǎo)致胃腸道缺血低氧，氧自由基急劇增多，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強導(dǎo)致組織細胞損傷，并產(chǎn)生大量MDA；(2)各種原因?qū)е聶C體損傷后，為了抑制過氧化脂質(zhì)啟動了抗脂質(zhì)過氧化的保護系統(tǒng)。由于氧自由基生成增多，一方面攻擊SOD、GSH-Px并使其失活，另一方面氧自由基的不斷產(chǎn)生消耗了大量SOD、GSH-Px，從而導(dǎo)致血清和組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低。

綜上所述，截癱家兔小腸組織MDA含量明顯增高，而SOD、GSH-Px活性降低，經(jīng)SDD處理后小腸組織內(nèi)MDA含量降低，而SOD、GSH-Px活性升高，提示家兔截癱后體內(nèi)脂質(zhì)過氧化顯著增強，但SDD可改善脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而保護腸黏膜。小腸HE染色Chiu氏病理評分與小腸組織MDA呈顯著正相關(guān)，與SOD、GSH-Px呈顯著負相關(guān)，表明小腸氧化應(yīng)激反應(yīng)與小腸病理學(xué)改變密切相關(guān)，氧化應(yīng)激參與了脊髓損傷后腸黏膜的破壞過程。在臨床實踐中搶救、治療脊髓損傷患者時，適當應(yīng)用SDD和抗氧化劑清除氧自由基[16-20]，減輕氧化應(yīng)激損傷，對提高患者對創(chuàng)傷的抵抗力，維持機體免疫調(diào)控能力，促進病情好轉(zhuǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

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