鄒俊駒 陸雅婷 吳佳敏 戴玉微 歐陽建軍 趙國榮 賀又舜

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

附子理中湯在方劑學(xué)中歸為溫里劑，是在溫法的理論指導(dǎo)下，以溫里藥為主，可溫陽祛寒，系治療里寒證的方劑。所謂溫法，是建立在溫?zé)嵝苑剿幍幕A(chǔ)上，溫煦陽氣，以達到驅(qū)里寒的一種療法 ，可用于治療陽氣不足所致的陰寒內(nèi)盛所致的里寒證。附子理中湯源于理中湯的化裁而來，想了解其作用特點與組方的配伍，其量效關(guān)系至關(guān)重要［1］。溫里劑多出于張仲景《傷寒論》《金匱要略》，經(jīng)方組方的法度嚴(yán)謹(jǐn)，臨床療效確切，毒副作用小，沿用千年，至今不衰，然而如何把握其中藥物量-效-毒之間的關(guān)系，均需考慮劑量折算問題，附子的用量問題就是一個很好的依據(jù)?；鹕衽蓞桥宕认壬鷮Υ髣┝繎?yīng)用附子也有自己的認(rèn)識：“病至危篤之時，處方用藥非大劑不能奏效”。因此，在驗證經(jīng)方量與效的關(guān)系時，現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的運用必不可少，從多角度多方位分析其量-效-毒之間的關(guān)系，對中醫(yī)藥關(guān)于方劑配伍的君臣佐使之間關(guān)系的肯定和配伍之間劑量變化所產(chǎn)生的藥物作用均具有重要的意義，通過對量-效-毒關(guān)系的研究，有利于闡明中藥與中藥之間的配伍機制，提高臨床的療效，保證用藥安全，為中醫(yī)急救期間由于量-效-毒的問題提供些許幫助［2］。 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（300±10）g，由湖南斯萊克景達動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2013-0004，所有大鼠放入SPF級動物房進行飼養(yǎng)，控制室溫（25±1）℃，控制濕度（55±1）%，動物房自然晝夜節(jié)律（12 h～12 h），適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周以上，實驗前12 h予以禁食，不禁水。

1.2 試藥與儀器 附子理中湯由制附子、人參、茯苓、炒白術(shù)、干姜組成，所有藥材購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。 附子理中湯（LZT）［3］：制附子 9 g，人參 9 g，干姜9 g，炙甘草9 g，白術(shù)9 g。首煎：附子加水適量先煎30 min，后下諸藥再煎20 min。倒出，復(fù)煎：加水適量煎煮30 min，倒出，2次藥混一起4層紗布濾過，濃縮至4 g/mL（每毫升含生藥4 g），保存于4℃冰箱中。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫試劑盒，長沙麗欣生物技術(shù)有限公司；RM6240BD型多道生理信號采集系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；Humalyzer2000型半自動生化分析儀；Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國Thermo Scien-tic日本儀器有限公司。

1.3 分組與造模 將40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組，即模型組，LZT高、中、低劑量組，每組10只。各組動物于造模成功后經(jīng)十二指腸灌胃相應(yīng)藥液，給藥劑量根據(jù)《中藥藥理實驗方法學(xué)》［4］中人與動物用藥量體表面積換算法折算大鼠劑量，LZT高劑量組：9.46 g/kg，LZT中劑量組4.73 g/kg，LZT低劑量組2.37 g/kg。模型組灌胃等體積蒸餾水。實驗前12 h大鼠予以禁食，不禁水，大鼠稱重后用10%烏拉坦12 mL/kg麻醉。背位固定于操作臺上，手術(shù)部位去毛、消毒，開腹，在幽門下找出十二指腸；聚乙烯管插入腸管中并固定于腹壁，留置供給藥用；將氣管與迷走神經(jīng)分離開；分離右側(cè)頸總動脈，頸總動脈切口，插入一根PE50聚乙烯管，以三通活塞連接多導(dǎo)生理記錄儀的壓力、心率傳感器，觀察收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）及心率（HR）變化；右側(cè)腿部去毛，消毒，切口；分離右側(cè)肢股動脈；股動脈切口，插入一根PE50聚乙烯管放血，監(jiān)測血壓、心率變化，待 MAP 穩(wěn)定至 30～40 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），維持20 min，即為模型成功標(biāo)準(zhǔn)，即刻結(jié)扎止血；觀察給藥后 3 h 血壓、呼吸、心電變化［5-6］。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 以多道生理信號采集系統(tǒng)描記試驗全程血壓、心率，并分析所有圖形數(shù)據(jù)。血清酶學(xué)檢查：實驗結(jié)束后各組大鼠腹主動脈取血（約4 mL），離心 15 min（3000 r/min，40℃），取上清放入-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。測定血清中MDA、SOD、cAMP的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。各組數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用 Student-Newman-Keuls 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 附子理中湯對失血低血壓大鼠的比較 見圖1，表1?；A(chǔ)SBP各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。放血后大鼠SBP明顯下降，給藥前SBP各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給藥3 h后LZT中、低劑量組SBP與模型組比較明顯升高 （P＜0.01），LZT高劑量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠血壓圖

2.2 附子理中湯對失血性低血壓大鼠DBP的影響

見圖1，表1。基礎(chǔ)DBP各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。放血后大鼠DBP明顯下降，給藥前和給藥3 h后LZT各劑量組DBP與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表 1 各組大鼠收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）的比較（mmHg/s，±s）

表 1 各組大鼠收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）的比較（mmHg/s，±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 收縮壓（SBP） 舒張壓（DBP）正常組 10 127.8±7.29** 103.05±7.38**模型組 10 32.68±2.74△△ 29.17±1.29△△LZT 高劑量組 10 92.93±2.52**△△ 80.95±1.65**△△LZT 中劑量組 10 80.59±1.43**△△ 76.82±1.41**△△LZT 低劑量組 10 50.59±5.12**△△ 42.95±2.51**△△

2.3 LZT對失血性低血壓HR的比較 見表2。放血后大鼠HR明顯減慢，基礎(chǔ)HR及給藥前HR各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥3 h后LZT低劑量組HR與模型組比較顯著增快（P＜0.01），LZT中、高劑量組HR與模型組比較顯著增快（P＜0.01）。

表 2 各組大鼠心率（HR）的比較（次/min，±s）

表 2 各組大鼠心率（HR）的比較（次/min，±s）

組 別 n 心率（HR）正常組 10 394.66±9.07**模型組 10 240±6.24△△LZT 高劑量組 10 324.00±8.892**△△LZT 中劑量組 10 272.679±5.06**△△LZT 低劑量組 10 245.00±6.24**△△

2.4 LZT對失血性低血壓大鼠氧化應(yīng)激的影響 見表3。與正常組比較，模型組血清MDA含量顯著升高，SOD、cAMP含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，LZT中、高劑量組血清SOD水平顯著升高（P＜0.01），低劑量組血清SOD水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，LZT中劑量組血清cAMP水平顯著升高（P＜0.01），高劑量組有差異（P＜0.05），低劑量組血清cAMP水平無差異 （P＞0.05）；與模型組比較，LZT中劑量組血清MDA水平顯著升高（P＜0.01），低劑量組血清MDA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表 3 各組大鼠 SOD、MDA、cAMP的比較（±s）

表 3 各組大鼠 SOD、MDA、cAMP的比較（±s）

組 別 n SOD（U/mg）正常組 10 122.45±4.75**模型組 10 54.48±5.91△△LZT 高劑量組 10 90.65±5.09**△△LZT 中劑量組 10 80.20±6.07**△△LZT 低劑量組 10 59.37±4.71△△cAMP（nmol/L） MDA（nmol/mg）11.81±6.12** 4.21±0.54**27.76±1.28△△ 22.58±5.12△△23.09±1.63*△△ 11.50±1.53**△△19.35±1.26**△△ 14.12±0.91**△△32.14±1.54△△ 23.64±2.50△△

3 討 論

附子理中湯出自《三因極一病證方論》，由《傷寒論》中的理中丸加附子而成，由制附子、人參、炒白術(shù)、干姜、炙甘草組成，具溫陽祛寒、益氣健脾之功，臨床主要用于脾胃虛寒而導(dǎo)致的脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、手足不溫等一派虛寒之象。方中以大辛大熱之干姜為君，溫胃散寒，扶陽抑陰；人參，補氣健脾；炮附子，大辛大熱之品，溫經(jīng)濟陽，以救欲絕之陽；參附相配，可復(fù)脈固脫，回陽救逆，佐以甘溫苦燥之白術(shù)，健脾益氣，配以炙甘草為使，以助參附術(shù)益氣之功，調(diào)和諸藥，降低附子之毒性。該方雖是在理中丸的基礎(chǔ)上加上了附子，對其進行剖析，其中有四逆湯、參附湯亦或是獨參湯的思想含義在內(nèi)，對元陽虛脫脈微欲絕者不失為回陽救逆之要劑，而且這類方劑在古代中醫(yī)臨床急救中具有十分重要的地位，《校注婦人良方》卷三更是指出凡氣虛卒中，不語口噤；或難產(chǎn)，產(chǎn)后不省，喘息者用獨參湯主之，如不應(yīng)，急加炮附子徐徐服之，元氣大虧，陽氣暴脫，喘息脈微，吐血咯血等；《醫(yī)方類聚》卷一使用參附湯來治療元氣大虧，陽氣暴脫，汗出厥逆，喘促脈微的患者；《傷寒論》中以四逆加人參湯來治療陽虛血脫之人。

葉蜀暉等發(fā)現(xiàn)附子的強心作用在臨床上對慢性充血性心力衰竭患者療效頗佳，藥理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)制附子具有強心作用［7］，王勝林等發(fā)現(xiàn)附子能顯著增強慢性心力衰竭模型動物的心臟收縮力，并具有一定的劑量依賴性［8］。鄧家剛等研究發(fā)現(xiàn)附子對陽虛型小鼠和離體衰竭的蛙心具有回陽救逆的效果，起到強心的作用，并存在量-效關(guān)系，附子總生物堿可緩解心肌缺血小鼠的心肌損傷，其調(diào)節(jié)機制可能與能量代謝和消除氧自由基損傷等有關(guān)［9］；人參皂苷能通過提高機體內(nèi)S0D、CAT、GSH-Px等的活性， 減少LPO、MDA 等的含量［10］，并且對血壓具雙向調(diào)節(jié)作用，Robert等發(fā)現(xiàn) Rc可減少缺氧大腦和心肌的乳酸量，并使心肌cAMP/cGMP恢復(fù)正常范圍，對心肌細胞的內(nèi)皮細胞具有保護作用［11-13］；周靜等發(fā)現(xiàn)干姜水煎液對急性心肌缺血大鼠 AngⅡ、TNF-α、MDA、NO 均有一定調(diào)控作用，證明干姜能改善急性心肌缺血大鼠的心功能，緩解其缺血缺氧狀態(tài)，發(fā)揮“回陽通脈”功效［14］；胡因銘等發(fā)現(xiàn)炙甘草湯能顯著降低再灌注心肌組織中MDA含量，增強 SOD 的活性［15］。

因血壓低的原因，導(dǎo)致遠端毛細血管因血液循環(huán)慢而產(chǎn)生了缺血，組織內(nèi)細胞的氧氣、營養(yǎng)的供給和新陳代謝過程受到影響。失血性低血壓的動物模型建立在大量失血的情況下，失血過多易導(dǎo)致失血性休克，全身有效循環(huán)血量和組織灌注不足，出現(xiàn)一系列由于缺血引起的急性臨床綜合征。在大失血情況下，組織細胞缺血缺氧、代謝產(chǎn)物儲留，使自由基產(chǎn)生和釋放平衡打亂［16-17］，臨床上表現(xiàn)為 MDA、cAMP 含量增多，SOD含量減少，組織細胞損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其水平高低反映脂質(zhì)過氧化程度，同時還間接反映機體自由基損傷程度［18］。SOD為細胞內(nèi)一種抗氧化酶，為清除生物體內(nèi)氧自由基的首要物質(zhì)，可抵抗氧自由基由于堆積對細胞造成的損害，還可及時修復(fù)受損細胞［19］。李科民等發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者心肌cAMP含量與心力衰竭成反比，而血液中cAMP含量則成正比［20-21］。

實驗結(jié)果顯示，大鼠在失血過多的情況下導(dǎo)致的血壓低至40 mmHg，心率明顯下降，在緊急缺血的狀態(tài)下循環(huán)血量大大下降，心肌缺血導(dǎo)致嚴(yán)重缺氧，SOD含量驟降，隨之MDA與cAMP的含量顯著升高，這些指標(biāo)均說明了在缺血的情況下心肌細胞受到了極大的損害，表明模型成功；在成模20 min后，分別給予LZT高、中、低劑量進行干預(yù)，各組指標(biāo)均有所改善，雖未能達到正常狀態(tài)，但是可緩解由于缺血導(dǎo)致的機體損傷。高劑量對收縮壓、舒張壓與心率的作用最顯著，其次到中劑量，低劑量效果不明顯；在氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)方面，LZT中、高劑量組可以增加SOD的含量，降低MDA與cAMP的含量，而低劑量組沒有效果，可能跟附子理中湯的劑量有關(guān)。本研究表明附子理中湯在一定劑量下能改善失血性低血壓大鼠血壓與心率；增加SOD生成，減少MDA與cAMP的生成，通過增加氧化應(yīng)激的能力，降低脂質(zhì)過氧化損傷，明顯改善失血性低血壓大鼠的缺血、缺氧狀態(tài)下所造成的損傷。本實驗初步探討了附子理中湯對失血性低血壓大鼠血壓、心率和氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響，但是其具體作用機制還不明確，有望進一步探討其保護作用及具體的機制。

［1］文樂兮.方劑中藥物量-效-毒關(guān)系的研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2009，15（5）：84-87.

［2］王付.用方配伍技巧［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2004：110-111.

［3］鄧中甲.方劑學(xué)［M］.2版.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2011：133-134.

［4］陳奇.中藥藥理實驗研究方法學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：425.

［5］Guarini S，Cainazzo MM，Giuliani D，et al.Adrenocorticotrop in reverses hemorrhagic shock in anesthetized rats through the rapid activation of a vagal anti-inflammatory pathway ［J］.Cardiovasc Rese，2004，63（2）：357-365.

［6］陳奇.中藥藥理實驗研究方法學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：125-126.

［7］葉蜀暉.強心合劑對48例慢性充血性心力衰竭患者左心室功能的影響［J］.陜西中醫(yī)，2005，26（2）：105-106.

［8］王勝林，董耀榮.附子水煎液對心梗后心力衰竭大鼠心室重構(gòu)的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥雜志，2010，37（S1）：243-245.

［9］鄧家剛，范麗麗，郝二偉，等.附子回陽救逆量效關(guān)系的實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（3）：656-658.

［10］雷秀娟，馮凱，孫立偉，等.人參皂苷抗衰老機制的研究進展［J］.氨基酸和生物資源，2010，32（1）：44-47.

［11］Robert AID.Novel phosphodiesterase type 5 inhibitors：Assessingh emodynamic effects and safety parameters［J］.Clinical Cardiology，2007，27（S1）：20-25.

［12］George I，Geddis MS，Lill Z.Myocardial function improved byelectromagnetic field induction of stress protein hsp70［J］.Journal of Cellular Physiology，2008，216（3）：816-823.

［13］Lee BH，Seo HW，Yoo SF，et al.DifFerential action of kr-31378，a novel potassium channel activator，on cardioprotectiveand hemodynamic effects［J］.Drug development research，2001，54：182-190.

［14］周靜，楊衛(wèi)平，李應(yīng)龍，等.干姜水煎液對急性心肌缺血大鼠血漿血管緊張素Ⅱ、血清腫瘤壞死因子-α、丙二醛、一氧化氮的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2014，25（2）：288-290.

［15］胡因銘，陳奇.炙甘草湯對大鼠實驗性心肌缺血-再灌注損傷的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，1995，1（創(chuàng)刊號）：18.

［16］Dohashi K，Ghosh B，Orak JK，et al.Kidney ischemia reperfusion：modulationofantioxidantdefemses［J］.MolCellBiochen，2000，205：125.

［17］Schauer RJ，Gerhes AL，Vonier D，et al.Glutathione protects the rat liver against reperfusion injury after prolonged warm ischemia［J］.Ann Surg，2004，239（2）：220.

［18］段晨生，劉保江，高艷，等.舒芬太尼后處理對犬心肌缺血-再灌注損傷中MDA和SOD的影響及其與JAK2-STAT3的關(guān)系［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（3）：329-330.

［19］朱慧民，李輝，米天民，等.紅豆杉多糖對Beagle犬心肌缺血再灌注損傷模型心肌NADPH氧化酶mRNA及SOD，MDA 的影響［J］.中草藥，2011，42（59）：935-939.

［20］李振魁.β腎上腺素受體與心力衰竭關(guān)系的研究［D］.重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2004.

［21］李科民，連祖光，崔普坤，等.充血性心衰患者血漿中環(huán)核苷酸的變化及意義［J］.心功能雜志，2001，23（4）：21-23.