張明哲，尹文秀，陳 哲，吳 姍，虞惠貞，張曉峰，許 瑾，李明福，吳 蓉

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基于單核苷酸多態(tài)性位點的土沉香物種鑒定

張明哲1，尹文秀1，陳 哲1，吳 姍1，虞惠貞1，張曉峰1，許 瑾2，李明福2，吳 蓉1

（1. 浙江省檢驗檢疫科學技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016；2. 中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

對土沉香，云南沉香.和馬來沉香3種沉香屬植物的ITS序列進行PCR擴增和測序，并通過DNAMAN軟件篩選出單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，土沉香序列第236位上的堿基為C，而云南沉香和馬來沉香為T，設計出土沉香特異性引物AS-F，AS-R和探針AS-P。實時熒光定量PCR實驗表明，該引物探針能特異性擴增土沉香，且檢測靈敏度可以達到0.01 ng·μL-1，是一種快速、靈敏的鑒定方法。

土沉香；實時熒光PCR；ITS；物種鑒定

土沉香，又稱白木香，屬瑞香科Thymelaeaceae沉香屬植物，為我國特有的珍貴觀賞藥用植物[1]，也是我國生產(chǎn)藥材沉香的唯一植物資源，于1999年被列為國家Ⅱ級重點保護野生植物[2]。2005年1月12日，瑞香科白木香屬的全部物種均被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES公約）附錄Ⅱ管制[3-4]。目前全球沉香屬樹種的野生資源主要分布在亞洲[4]。我國土沉香主要分布于廣東、海南、廣西、福建，喜生于低海拔的山地、丘陵以及路邊陽處疏林中[5]。土沉香老莖受傷后所積得的樹脂，俗稱沉香，可作香料原料，并為治胃病特效藥；樹皮纖維柔韌，色白而細致可做高級紙原料及人造棉；木質(zhì)部可提取芳香油，花可制浸膏[5]。沉香系傳統(tǒng)中藥、名貴香料，具有悠久利用史，其藥用、精油、香料等方面市場需求量巨大[6]。近年來，其較高的社會和經(jīng)濟學價值，吸引了化學、生物學、病理學、材料科學等多學科研究人員的關注，且部分研究成果已在中醫(yī)藥學等相關領域得到應用[4]。

我國的土沉香資源十分豐富，歷史上就有“交干連枝，崗嶺相接，千里不絕”的記載，而且國產(chǎn)沉香品質(zhì)優(yōu)良，有“冠絕天下”的美稱[7]。但近年來土沉香生存環(huán)境遭到破壞，一方面自然繁殖率下降；另一方面為了產(chǎn)香、取香，人為地對土沉香樹進行傷害，甚至砍倒，影響土沉香正常生長和繁殖，土沉香林面積急劇下降[7]。同時，隨著中藥現(xiàn)代化的快速發(fā)展和香客、收藏愛好者對沉香的熱衷，沉香的需求日益增加，野生資源和傳統(tǒng)的人工結(jié)香已經(jīng)遠遠不能滿足需求，市場上摻假造假的現(xiàn)象也日益凸顯。為加強沉香屬物種資源的保護和利用，規(guī)范市場秩序，本研究基于沉香屬不同種間單核苷酸多態(tài)性位點的差異，設計特異性引物探針，建立了土沉香分子生物學鑒定方法，對口岸快速篩查和鑒定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年3－7月，采集土沉香葉片13份（云南、海南、廣東、廣西），云南沉香葉片3份（云南）和馬來沉香木材1份（馬來西亞），共17份。采集樣本為任意部位的新鮮葉片，數(shù)量若干，部分放在密封袋中，以供試驗，剩余樣品置于－20℃冰箱保存。木材樣本為檢查截獲的馬來沉香樣品。

1.2 方法

表1 通用引物ITS2

1.2.1 DNA樣品的制備 DNA提取在無菌環(huán)境下進行，采用改良的DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）[8]。DNA提取之前，先將Qiagen試劑盒中的Buffer AP1在65℃水浴鍋中預熱。葉片經(jīng)無菌水沖洗并用已滅菌的濾紙擦干，木材用75%的乙醇對表面進行徹底的消毒，再經(jīng)無菌水沖洗并用已滅菌的濾紙擦干[9]，將植物葉片、木材研磨成粉末狀，取0.1 g粉末至2 mL離心管，加入400 μL預熱的Buffer AP1，4 μL RNase A，充分混合后65℃溫浴10 min，然后加入130 μL的BufferP3，迅速混勻后在冰上冷卻5 min。接下來的步驟，參照試劑盒說明書。

表2 土沉香引物探針

注：探針5’端標記FAM報告熒光染料，3’端標記BHQ1淬滅熒光染料。

1.2.2 引物和探針 本研究篩選出沉香屬通用引物（ITS2[10])，可有效擴增沉香屬樣本，擴增長度約為500 bp（表1）。引物、探針由TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。以通用引物擴增產(chǎn)物為目標序列，通過DNAMAN軟件篩選出多態(tài)性位點，利用Primer Premier 5.0軟件設計出土沉香特異性鑒定引物和探針（表2）。

1.2.3 反應體系及條件 普通PCR反應體系：采用大連寶生物（TaKaRa Ex Taq）提供的試劑，10×Ex Taq Buffer 2.0 μL（Mg2+plus），dNTPs 1.6 μL（各2.5 mM），引物各0.4 μL（20 μM），ddH2O 13.5 μL，Taq酶0.1 μL（5 U·μL-1），DNA模版2 μL（10 ~ 40 ng·μL-1）。擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。使用PCR儀（S1000）擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至杭州擎科梓煕生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。實時熒光PCR反應體系：采用大連寶生物（TaKaRa Ex Taq）提供的試劑，實時熒光PCR預混液（2×）10 μL，正反向引物（20 μM）各0.4 μL，探針（10 μM）0. 8 μL，ROX（50×）0.4 μL，DNA模板2 μL，滅菌雙蒸水6 μL。反應條件：（1）95℃，30 s；（2）95℃，15 s；（3）65.5℃，34 s。（1）~（3）循環(huán)40次。使用熒光定量PCR儀（ABI7500Fast）進行檢測。

1.2.4 序列測定與數(shù)據(jù)分析 通用引物ITS2可有效擴增沉香屬樣本，擴增長度467 bp。以該引物擴增產(chǎn)物為目標序列，通過DNAMAN軟件篩選多態(tài)性位點（圖1）。一共有6個變異位點，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)位于土沉香ITS基因所示序列第236位上的堿基可區(qū)分土沉香和馬來沉香、云南沉香。土沉香序列第236位上的堿基為C，而云南沉香和馬來沉香為T，以此位點差異利用Primer Premier 5.0軟件設計出土沉香特異性鑒定引物和探針（表2）。因為土沉香13個樣本的擴增結(jié)果相同，云南沉香3個樣本的擴增結(jié)果也相同，故選取任意3條土沉香序列與1條云南沉香序列進行比對分析。

圖1 土沉香、云南沉香和馬來沉香序列比對

Figure 1 Sequence comparison of,and

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針對實時熒光PCR擴增的影響

本研究基于單核苷酸多態(tài)性位點，設計出土沉香特異性鑒定引物和探針，通過對反應體系和條件進行不斷優(yōu)化，最終確定了1.2.3中的實時熒光PCR反應體系。實時熒光PCR擴增結(jié)果表明，該引物探針能特異性擴增土沉香，對云南沉香、馬來沉香樣本和空白對照并沒有擴增（圖2），故本研究中設計的引物探針可快速篩查出土沉香。同時，該特異性引物和探針具有良好的擴增效率，當模板濃度低至0.01 ng·μL-1時，仍具有明顯的擴增（圖3）。檢測結(jié)果重復3次，均獲得相同結(jié)果。

圖2 土沉香實時熒光PCR特異性擴增結(jié)果

Figure 2 Real-time PCR specific amplification of

圖3 土沉香不同濃度梯度實時熒光PCR擴增結(jié)果

Figure 3 Real-time PCR amplification ofwith different concentration of template

2.2 不同模板濃度梯度的熒光PCR擴增

以引物AS-F和AS-R以及熒光探針AS-P對3個沉香屬樹種進行實時熒光PCR擴增，結(jié)果見圖2。土沉香隨機選取2個樣本，其余沉香屬樣品選取1個樣本，每個樣本2個重復。出現(xiàn)擴增曲線的為土沉香樣本，未出現(xiàn)擴增的為云南沉香、馬來沉香和空白對照。以引物AS-F和AS-R以及熒光探針AS-P對土沉香進行不同濃度梯度的熒光PCR擴增，結(jié)果見圖3。擴增曲線自左至右表示土沉香DNA模板最大濃度為10 ng·μL-1，按10倍梯度稀釋，共7個濃度梯度，最低為1×10-5ng·μL-1，每一濃度2個重復。當模板濃度低至0.01 ng·μL-1時，仍有擴增。檢測結(jié)果重復3次，均獲得相同結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究對土沉香、云南沉香和馬來沉香的ITS序列進行PCR擴增和測序，經(jīng)比較分析，篩選出了單核苷酸多態(tài)性位點，土沉香序列第236位上的堿基為C，而云南沉香和馬來沉香為T，并設計出可鑒定土沉香的特異性引物AS-F、AS-R和探針AS-P。實時熒光定量PCR實驗表明，該引物探針能特異性擴增土沉香，且檢測靈敏度可以達到0.01 ng·μL-1，是一種可快速、靈敏辨別土沉香與云南沉香和馬來沉香的方法。

3.2 討論

在物種鑒定過程中，雖然傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法仍然占有主導地位，但是近年來，由于分子生物學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究者利用分子生物學方法進行物種鑒定。這主要是DNA序列數(shù)據(jù)庫的迅猛發(fā)展給物種鑒定提供了豐富的資源；另一方面，利用分子生物學方法進行物種鑒定不僅簡單、快捷，而且準確性高，避免了形態(tài)學鑒定中存在的局限性。形態(tài)學鑒定主要依賴專業(yè)鑒定人員較高的鑒定技能和豐富的鑒定經(jīng)驗，但不能排除鑒定者對物種形態(tài)特征主觀感受的差異。分子生物學作為一種精確地分析鑒定手段，有別于傳統(tǒng)的形態(tài)學，能從遺傳角度鑒別物種，具有鑒定過程快捷便利，適合大量樣本的鑒定；穩(wěn)定且重復性高；標準化實驗過程，操作要求簡單等獨特優(yōu)勢[11]。由于沉香屬植物的外表相似，特別是木材制品種與種之間難以區(qū)分，故利用分子生物學技術(shù)進行沉香物種的鑒定與分類勢在必行。有實驗表明，土沉香的新鮮材及其高溫干燥樣品可以通過DNA條形碼準確識別[12]。還有實驗運用CTAB法聯(lián)合DNA試劑盒法，簡單、快速獲得高質(zhì)量沉香總DNA，透過正交試驗快速獲得ITS2目的片段，為沉香的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析提供參考[13]。本研究在土沉香DNA條形碼的基礎上，篩選出單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點并進一步設計了特異性的引物和探針，結(jié)果判定準確和快捷，避免了條形碼在數(shù)據(jù)庫比對中的不唯一性和條形碼方法進行測序和比對等過程的低效性。通過反復實驗并驗證特異性引物探針，采用實時熒光定量PCR技術(shù)進行鑒定，有利于口岸快速篩查和準確鑒定，有效地保障了土沉香的流失，對物種資源保護具有重要意義。

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Identification ofby Single Nucleotide Polymorphism

ZHANG Ming-zhe1，YIN Wen-xiu1，CHEN Zhe1，WU Shan1，YU Hui-zhen1，ZHANG Xiao-feng1，XU Jin2，LI Ming-fu2，WU Rong1

（1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Hangzhou 310016, China; 2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China）

Leaves were collected and timbers of,andwere quarantined from March to July of 2017 from different provinces in China, and were amplified and sequenced. Screening of single nucleotide polymorphisms (SNP) by DNAMAN software, specific primers and probes were designed for. The real-time PCR test showed that the primer and probe could specifically amplify, and the sensitivity reached 0.01 ng·μL-1.

Real-time PCR; ITS; species identification

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.06.005

Q949.761.1

A

1001-3776（2018）06-0029-04

2018-05-21；

2018-09-09

國家重點研發(fā)計劃課題（2017YFF0210304）；浙江省重點研發(fā)計劃項目（2018C02041）；浙江省科技廳公益性項目（2017C32045）

張明哲，博士，高級農(nóng)藝師，從事物種鑒定和轉(zhuǎn)基因檢測研究；E-mail：mzzhang429@163.com。