魏靈敏， 段延碧， 龍雯虹， 張雪梅， 孟金貴

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南昆明 650201； 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科實驗教學(xué)示范中心，云南昆明 650201； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

山藥(Dioscoreaopposita)是我國大眾化菜藥兼用的滋補食品，藥用價值高，有健脾、固精、補肺、益腎的功能[1]。生產(chǎn)上用莖段進行繁殖，繁殖系數(shù)低，生產(chǎn)成本高。趙冰等對山藥栽培特性進行觀測，發(fā)現(xiàn)只有用珠芽對山藥進行更新復(fù)壯，才可解決山藥長期栽培后出現(xiàn)種性退化的問題，但珠芽發(fā)芽需數(shù)月之久，影響生產(chǎn)上的適時播種[2]。

通常認(rèn)為，休眠由內(nèi)源激素控制，休眠的起始、終止和調(diào)控以及休眠階段的各層次變化均受激素調(diào)節(jié)[3]。前人對山藥珠芽的激素調(diào)控進行了一定的研究，龍雯虹等探索出用多效唑針刺珠芽中部可促進珠芽發(fā)芽，并用不同濃度的多效唑和矮壯素水溶液處理不同休眠期的山藥珠芽，證明了1～10 mg/L 多效唑水培能顯著打破采后60 d的珠芽休眠[4]；在此基礎(chǔ)上，王軍民等用多效唑和氯吡脲配施對山藥珠芽及中后期長勢的影響進行了相關(guān)研究[5]；苗麗娟等發(fā)現(xiàn)2%和5%的雙氧水促進收獲后60 d的珠芽提早出芽[6]；另外，龍雯虹等分別測定了不同生長階段的山藥珠芽內(nèi)源激素IAA、ZR、DHZR、GA3和ABA的含量，探討了GA3/ABA的比值變化，發(fā)現(xiàn)生長期ZR的含量變化大，且GA3含量較高[7]，并對珠芽休眠期內(nèi)源激素含量做了相關(guān)研究，證明珠芽發(fā)芽需要GA3含量降低和ZR含量升高，PP333使GA3含量下降速度加快，縮短了珠芽的休眠期[8]。

前人用10 mg/L的PP333處理珠芽后對內(nèi)源激素GA3的含量進行了測定[8]，但仍不能解釋PP333等生長抑制劑對休眠期珠芽效應(yīng)不同的現(xiàn)象。同時，珠芽的休眠是由萌發(fā)抑制物和生長促進物間的平衡所決定，為此該研究測定了不同濃度PP333處理后休眠期珠芽的赤霉素(GA3)、細(xì)胞分裂素異戊烯基腺苷(iPA)、玉米素核苷(ZR)和二氫玉米素核苷(DHZR)含量變化，并對激素間的平衡關(guān)系進行了探討，旨在探索出休眠期珠芽內(nèi)源激素的變化規(guī)律及對多效唑的響應(yīng)，為將來研究對珠芽進行外源激素的調(diào)控打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛尾山藥種苗來源于云南省祿豐縣，選取當(dāng)年無病蟲害、飽滿的山藥珠芽為試驗材料。

1.2 PP333處理山藥珠芽

將收獲后放于室內(nèi)60 d的珠芽用多菌靈500倍液浸泡10 min后用清水洗凈，擦干珠芽表面水分，用5、25、45、65、85 mg/L PP333溶液浸泡珠芽24 h后，取出珠芽裝于培養(yǎng)皿，用濕潤蛭石培養(yǎng)。以蒸餾水處理作對照，每處理100粒珠芽，重復(fù)3次。每隔7 d隨機各取5粒珠芽，切碎混勻后置入液氮中冷凍15 min后，放入-20 ℃冰箱以備測定內(nèi)源激素iPA、ZR、DHZR、GA3的含量，取樣直到珠芽發(fā)芽為止。

1.3 內(nèi)源激素含量測定

激素的提取方法：稱取樣品0.5～1.0 g，在弱光和冰浴條件下，加入2 mL 80%甲醇提取液(含1 mmol/L二叔丁基對甲苯酚)研磨成漿，轉(zhuǎn)入離心管中，再用3 mL提取液洗研缽3次，4 ℃提取4 h，其間手動搖離心管數(shù)次；4 h后4 ℃下 3 500 r/min、離心8 min，取上清液轉(zhuǎn)入10 mL定容瓶中，剩下殘渣用3 mL提取液4 ℃下提取1 h，離心后取上清液轉(zhuǎn)入 10 mL 定容瓶中，將剩下殘渣用2 mL提取液提取、離心，合并所有上清液，定容至10 mL，即得激素提取液。

激素的測定方法：取1 mL提取液-氮氣吹干-樣品稀釋液溶解-用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定激素，測定方法和試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)化控中心提供。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS軟件進行處理和分析。

式中：N為測定濃度；V2為提取液總體積；V3為定容稀釋液體積；B為稀釋倍數(shù)；V1為真空濃縮上清液體積；W為植物樣品鮮質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 休眠期至生長期內(nèi)源激素含量變化

如圖1所示，GA3和ZR含量變化呈現(xiàn)“下降—上升—下降—上升”的趨勢，iPA和DHZR含量經(jīng)歷了2個波峰后，最后均呈現(xiàn)出上升的趨勢。至培養(yǎng)7 d時，DHZR、ZR和iPA的含量均出現(xiàn)下降；在7～21 d時，ZR和GA3含量呈現(xiàn)急速的下降趨勢，iPA和DHZR含量則經(jīng)歷了1個波峰，且在21 d時，iPA和DHZR含量與它們最開始的激素水平相持平；在休眠后期(21～35 d)，GA3含量隨著休眠的深入而不斷升高，DHZR、ZR和iPA的含量呈波動式上升；在萌芽期(35～42 d)，除iPA含量上升外，其他激素含量均下降到最低值；在生長期(42～56 d)，4種激素含量表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，且在56 d均達到了峰值；ZR含量在整個休眠期至生長期始終遠高于DHZR、GA3和iPA的含量。

2.2 休眠期至生長期內(nèi)源激素含量比值的動態(tài)變化

如圖2所示，在休眠期(0～35 d)，iPA/GA3、DHZR/GA3和ZR/GA3比值呈現(xiàn)“下降—上升—下降”的趨勢；在萌芽期(35～42 d)，iPA/GA3、DHZR/GA3和ZR/GA3比值均呈現(xiàn)上升的趨勢，其中iPA/GA3比值上升最為明顯，由此可知，培養(yǎng)35～42 d時GA3含量的下降，促使iPA/GA3、DHZR/GA3和ZR/GA3的比值回升，促進了休眠的解除。在生長期(42～56 d)，隨著GA3含量的快速上升，激素間的比值則快速下降。

在休眠期至生長期，GA3與iPA含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是0.574；ZR與GA3含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是 0.894；ZR與iPA、iPA與DHZR、ZR與DHZR、GA3與DHZR含量均呈不相關(guān)，表明它們之間關(guān)系不緊密。

2.3 PP333處理后內(nèi)源激素含量的動態(tài)變化

如圖3所示，DHZR含量在培養(yǎng)14 d達到高峰，但隨后迅速下降，在21～35dDHZR含量有較小的起伏；在35～42d時，85 mg/L PP333處理呈現(xiàn)大幅度的上升，且高于其他處理的含量，這一階段其他處理沒有明顯變化。方差分析表明，相同濃度的處理在不同時期珠芽DHZR含量差異極顯著(F=4.741，P=0.000<0.01)；同時期不同濃度處理間DHZR含量差異不顯著。

在PP333處理0～7 d，45～65 mg/L的PP333處理ZR含量呈現(xiàn)上升趨勢，其余處理則呈現(xiàn)下降趨勢；在休眠中期(7～21 d)，除85 mg/L PP333處理經(jīng)歷了1個波峰外，這一階段其他處理則急速下降至最低值；在萌芽期(35～42 d)，45 mg/L PP333和85 mg/L PP333處理呈現(xiàn)大幅度的上升，這一階段其他處理表現(xiàn)為下降趨勢；在休眠破除時(42 d)，所有處理的含量均高于對照，說明PP333對ZR含量有一定的促進作用。方差分析表明，相同濃度的處理在不同時期珠芽的ZR含量差異極顯著(F=11.825，P=0.000<0.01)；同時期不同濃度處理間ZR含量差異不顯著。

經(jīng)PP333處理過的珠芽iPA含量在休眠中期(7～21 d)表現(xiàn)為“低濃度促進、高濃度抑制”的趨勢；在萌芽期(35～42 d)，所有處理均呈現(xiàn)大幅度的上升。方差分析表明，同時期不同濃度處理間iPA含量差異不顯著；相同濃度處理在不同時期珠芽的iPA含量差異顯著(F=2.561，P=0.017<0.05)。

經(jīng)5～65 mg/L PP333處理的珠芽GA3含量在0～21 d均表現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為PP333的作用機理是抑制植物內(nèi)部GA3的產(chǎn)生。在休眠后期(21～35 d)，5～65 mg/L PP333的處理均經(jīng)歷了1個波峰，對照在這一階段持續(xù)上升；在萌芽期(35～42 d)，GA3保持低含量水平；在生長期(42～56 d)，全部處理GA3含量呈現(xiàn)快速的上升趨勢。方差分析表明，相同濃度的處理在不同時期珠芽的GA3含量差異極顯著(F=7.019，P=0.000<0.01)；同時期不同濃度處理間GA3含量差異不顯著。

2.4 PP333處理后內(nèi)源激素間比值的動態(tài)變化

如圖4所示，各處理的激素比值變化趨勢基本一致，在培養(yǎng)0～21 d時，DHZR/GA3、iPA/GA3和ZR/GA3的比值均出現(xiàn)大幅度上升；在休眠中期(21～35 d)，4種激素之間比值繼續(xù)下降，由于生長促進類激素iPA、DHZR含量下降到較低水平，GA3含量此時呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，使得DHZR/GA3、iPA/GA3比值基本小于1，此時ZR/GA3的比值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，為珠芽的萌發(fā)做準(zhǔn)備；在萌芽期(35～42 d)，GA3含量緩慢下降，使DHZR/GA3和iPA/GA3的比值有回升趨勢；在生長期(42～56 d)， DHZR/GA3、iPA/GA3和ZR/GA3的比值均表現(xiàn)出不同程度的下降趨勢，這可能是生長期間GA3含量遠高于ZR、iPA、DHZR的含量而導(dǎo)致的結(jié)果。

珠芽激素(iPA+ZR+DHZR)/GA3的比值在休眠期至生長期經(jīng)歷了2個波峰，在休眠期(0～28 d)，所有處理均呈上升趨勢，而在處理14～21 d 85 mg/L PP333處理(iPA+ZR+DHZR)/GA3比值低于其他處理的比值，在處理42 d時，85 mg/L PP333處理比值遠高于其他處理。由此可知，PP333在休眠期能促進細(xì)胞分裂素含量的增加，以85 mg/L PP333處理的效果最為明顯，其他濃度PP333處理的激素比值則與對照的比值差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

3.1 內(nèi)源激素與珠芽休眠萌發(fā)的關(guān)系

該試驗結(jié)果表明，iPA含量變化與山藥珠芽的發(fā)育過程相一致。休眠期iPA含量一直較低，原因可能是休眠的珠芽在聚集能量以抵御寒冷的氣候和為珠芽提供過冬的營養(yǎng)物質(zhì)，又或者iPA可能并未直接參與休眠的解除。在生長期iPA含量急速上升，由此猜測iPA的作用在于珠芽解除休眠后的萌發(fā)生長。經(jīng)初步分析，iPA含量增加是因為營養(yǎng)需求增加，反之亦然。

種子休眠的解除總是與赤霉素類物質(zhì)的積累相伴發(fā)生[9]。未經(jīng)PP333處理的珠芽GA3含量經(jīng)歷先升再降最后升高的過程，在休眠期低溫促進了GA3的合成，促使GA3含量的持續(xù)升高，這與龍雯虹等的研究[10]一致，而經(jīng)PP333處理的珠芽經(jīng)歷了下降再升高的過程，即PP333抑制休眠期GA3的升高，而休眠解除時GA3含量達最低值，這一結(jié)果與前人研究GA3抑制珠芽發(fā)芽的結(jié)論[11-12]一致，至生長期GA3含量升高，可能是因為GA3需較高水平才有利于種子細(xì)胞分裂、伸長和種子發(fā)育所需的養(yǎng)分吸收[13]，因此GA3在珠芽的休眠期至生長期起著雙重作用，即先抑制萌發(fā)、后促進生長，有關(guān)這一現(xiàn)象的內(nèi)在機理還需進一步探索。

ZR具有抵消萌發(fā)抑制物質(zhì)、調(diào)控種子發(fā)育中的物質(zhì)和能量代謝的作用[14]。本試驗結(jié)果表明，ZR含量隨著休眠程度的加深而增加，由此推測ZR在休眠期加快了細(xì)胞分裂分化的速度，加厚了珠芽的外皮，提高了對珠芽的保護能力。在休眠期DHZR、GA3和iPA含量上升的作用是促進細(xì)胞分裂，高含量的生長促進類激素ZR迅速降低減少了對GA3的制約，使GA3在珠芽的休眠中發(fā)揮主要作用。隨著休眠的解除，ZR含量快速上升，此時，細(xì)胞分裂素可能促進細(xì)胞分裂和擴大，誘導(dǎo)了珠芽的分化。因此，ZR能夠克服萌發(fā)抑制的因子，解除休眠，促進珠芽的萌發(fā)。

DHZR含量在休眠至萌發(fā)期較其他激素低，休眠期DHZR含量上升是為了聚集能量，休眠后期的緩慢下降可能是受到低溫和GA3共同抑制作用。

3.2 珠芽休眠期至萌發(fā)期內(nèi)源激素間的平衡關(guān)系

由內(nèi)源激素間比值變化可以看出，較低的DHZR/GA3、iPA/GA3和ZR/GA3比值有利于休眠。其中DHZR/GA3和iPA/GA3通過低比值減少對休眠的抑制，從而對休眠發(fā)揮間接的調(diào)控作用。ZR/GA3比值進入休眠期迅速下降，休眠后期又明顯回升，與休眠進程相一致，因此認(rèn)為ZR與GA3間的平衡變化對休眠的調(diào)控起主要作用。

根據(jù)內(nèi)源激素間的相關(guān)性分析，iPA與GA3、ZR與GA3的相關(guān)性較緊密，且iPA/GA3和ZR/GA3比值變化趨勢相同，說明GA3解除休眠作用與內(nèi)源激素平衡有關(guān)，但內(nèi)源激素之間具體的協(xié)同作用機理有待進一步研究。

3.3 PP333對珠芽內(nèi)源激素的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，5～65 mg/L PP333處理的珠芽和對照同時萌發(fā)，在解除休眠期85 mg/L PP333處理的珠芽GA3含量最低，這一變化使處理比對照提前7 d發(fā)芽，這與龍雯虹等研究的PP333處理能加快珠芽休眠后期GA3含量下降的速度，使珠芽提前發(fā)芽的結(jié)論[8]相一致，也與王鵬等在馬鈴薯的休眠研究中認(rèn)為GA3在調(diào)節(jié)萌發(fā)和解除休眠時起重要作用，抑制劑和細(xì)胞分裂素起輔助作用的結(jié)論[15]一致。同時，萌發(fā)期不一致或許是珠芽對不同濃度PP333處理的感應(yīng)程度不同。

經(jīng)PP333處理的珠芽ZR含量在萌芽期均高于對照，GA3含量在休眠期均低于對照，說明PP333有助于提高萌芽期ZR含量，降低休眠期GA3含量。通過內(nèi)源激素間的比值關(guān)系，可以看出山藥珠芽的休眠進程取決于多種內(nèi)源激素的平衡，而不是取決于單一激素的含量，所以筆者認(rèn)為山藥珠芽促成栽培的研究不應(yīng)僅僅局限于通過施用外源PP333解除珠芽休眠，而應(yīng)充分利用其他植物激素，同時重視對外部環(huán)境因素綜合而深入的研究，尋求打破山藥珠芽休眠的有效方法，從而促進山藥的周年商業(yè)生產(chǎn)。

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