朱金鑫， 孫金金， 原曉龍， 王 娟， 楊宇明， 王 毅

(1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224； 2.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明 650201； 3.國家林業(yè)局重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室/云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室/云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201)

牡丹屬芍藥屬牡丹組，具有很高的觀賞和藥用價(jià)值[1-2]，牡丹籽油作為中藥丹皮(牡丹根皮)生產(chǎn)中的副產(chǎn)品，其食用藥用價(jià)值逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，并不斷加強(qiáng)重視。研究人員發(fā)現(xiàn)，牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用潛力[3]。滇牡丹(Paeoniadelavayi)主要分布在云南省中部至西北部、西藏自治區(qū)東南部和四川省西南部海拔 1 900～3 600 m的部分區(qū)域，是中國西南地區(qū)特有的珍稀種質(zhì)資源，1992年中國植物紅皮書將滇牡丹列為漸危種，1996年中國野生植物保護(hù)條例將滇牡丹定為國家二級保護(hù)植物[4-7]。滇牡丹雖然自然分布狹窄，但其栽培范圍廣[4]，因此具有極大的引種馴化和育種空間，應(yīng)用價(jià)值高。

超長鏈單不飽和脂肪酸(very long chain monounsaturated fatty acid，簡稱VLCMFA)是指主鏈上碳原子數(shù)≥18，有且僅有1個(gè)雙鍵的脂肪酸[8]。VLCMFA在生物體內(nèi)參與生物膜膜脂、鞘脂的合成，是角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成的前體物質(zhì)[9]，VLCMFA不僅在生物體內(nèi)具有廣泛的重要作用，而且具有獨(dú)特的醫(yī)療保健、化工用途，高單不飽和脂肪酸食用油具有降血脂、保護(hù)心腦血管、促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育等優(yōu)點(diǎn)[10-11]，在工業(yè)上可以制備人造纖維、表面樹脂、油漆干性劑等重要化工原料[12-13]。VLCMFA在生物體內(nèi)主要以油酸等單不飽和脂肪酸為底物，在脂肪酰-CoA延長酶復(fù)合體的催化下合成，其中脂肪酰-CoA延長酶復(fù)合體包括4個(gè)酶：3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase，簡稱KCS)、3-酮酯酰-CoA還原酶(3-ketoacyl- CoA reductase，簡稱KCR)、3-羥酯酰-CoA脫水酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrase，簡稱HCD)、羥酯酰-CoA還原酶(enoyl-CoA reductase，簡稱ECR)[14-15]，其中KCS催化步驟是其中的關(guān)鍵步驟[16]，因此被認(rèn)為是VLCMFA生物合成途徑中的限速酶而得到廣泛研究。目前KCS已經(jīng)在油菜[17-18]、大豆[19-20]、油桐[21]、油茶[22]等傳統(tǒng)油料作物中被廣泛研究，2011年中華人民共和國衛(wèi)生部將牡丹籽油列入新資源食品后[23]，油用牡丹迅速成為研究熱點(diǎn)。本研究從滇牡丹中克隆得到KCS基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制及獲得含高VLCMFA油用品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

滇牡丹種子于2014年6—9月采集于云南省昆明市林業(yè)科學(xué)院樹木園苗圃，樣本經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待用?？俁NA小量提取試劑盒購自美國Qiagen公司，pESY-T3克隆試劑盒與感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，LA-Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PdKCS基因的克隆 通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得1個(gè)只含有部分滇牡丹KCS基因的序列片段，根據(jù)該基因片段序列設(shè)計(jì)特異性引物5′-RACE引物(本試驗(yàn)所用引物見表1)對 5′-基因片段進(jìn)行克隆。按照總RNA小量提取試劑盒操作步驟提取總RNA，檢測總RNA濃度及完整性后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。按照試劑盒操作步驟擴(kuò)增獲得PdKCS基因5′端序列片段，利用ATGC序列拼接軟件將5′-RACE獲得的基因片段和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的基因片段進(jìn)行拼接后獲得PdKCS全長基因序列。以PdKCS基因全長序列為模板，設(shè)計(jì)含有起始密碼子和終止密碼子的特異性引物PdKCSF、PdKCSR，以滇牡丹種子cDNA為模板，PdKCSF和PdKCSR為引物擴(kuò)增PdKCS基因cDNA開放閱讀框全長序列，PCR反應(yīng)體系參考PrimeScriptTMKit。擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 延伸7 min。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入pESY-T3載體中送測序公司檢測并驗(yàn)證。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam)在線工具分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；應(yīng)用ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測分析；應(yīng)用Tmpred(http：//www.ch.embnet.org/soft-ware/TMPRED_form.html)在線工具分析蛋白質(zhì)序列跨膜結(jié)構(gòu)域；應(yīng)用Cell-PLoc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；應(yīng)用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast和DNAMAN生物學(xué)軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對分析；利用軟件MEGA 5.0以鄰位連接法構(gòu)建氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹；數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism v5.0進(jìn)行分析制圖。

表1 引物序列

1.2.3 熒光定量PCR檢測PdKCS組織表達(dá)分析 以獲得的PdKCS基因序列為模板設(shè)計(jì)特異性引物PdKCSFt和PdKCSRt；分別采集滇牡丹授粉后30、50、70、90 d的種子，采集后立即放入液氮中。用RNA小量提取試劑盒提取滇牡丹不同發(fā)育時(shí)期的種子總RNA，電泳檢測后-80 ℃保存；參照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV試劑盒合成cDNA，保存于 -20 ℃；RT-PCR反應(yīng)用熒光染料SYBR Green Ⅰ，GAPDH為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 25 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃單點(diǎn)檢測信號。反應(yīng)結(jié)束后，60 ℃連續(xù)檢測信號產(chǎn)生溶解曲線。用Opticon monitor 3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄和分析。每個(gè)樣品3次重復(fù)，滅菌水為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdKCS基因的克隆與序列分析

通過分析滇牡丹種子轉(zhuǎn)錄組獲得的KCS基因片段，依據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)5′-RACE基因擴(kuò)增特異性引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增5′-RACE獲得基因片段，利用ATGC序列拼接軟件，最終獲得全長cDNA序列1 527 bp，命名為PdKCS，序列提交GenBank(登錄號KX524949)。利用NCBI ORF Finder軟件對拼接數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示PdKCS基因片段包含完整的cDNA開放閱讀框，編碼502個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG，終止密碼子TAA，并根據(jù)獲得的PdKCS基因全長設(shè)計(jì)含有起始密碼子和終止密碼子的特異性引物，以cDNA為模板擴(kuò)增獲得PdKCS基因開放閱讀框，并將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到克隆載體中，進(jìn)行永久保存。

2.2 PdKCS蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，PdKCS分子式為C2 534H4 008N688O709S23，相對分子質(zhì)量為56 193.2，理論等電點(diǎn)為9.36，脂肪酸系數(shù)為96.1，親水性平均系數(shù)為-0.026，不穩(wěn)定指數(shù)為40.61，該蛋白為堿性親水不穩(wěn)定蛋白(圖1)。

PdKCS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖2所示，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示PdKCS定位于質(zhì)體膜。

2.3 PdKCS氨基酸序列比對分析

將克隆出來的PdKCS基因編碼的氨基酸蛋白序列與已報(bào)道的KCS的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對。結(jié)果顯示，該蛋白與已報(bào)道的PdKCS含有KCS家族的高度保守區(qū)“PTPSLSAM”“FGNTSSSS”“GSGFKCNSAVW”和催化區(qū)域“GMGCSA”(圖3)，表明該蛋白屬于KCS家族蛋白。PdKCS的氨基酸序列與花生(Arachishypogaea)氨基酸序列(登錄號：ACZ51240.1)相似性達(dá)65.45%，與油茶(Camelliaoleifera)氨基酸序列(登錄號：ACQ41892.1)相似性達(dá)84.46%，與可可(Theobromacacao)氨基酸序列(登錄號：XP_007042184.1)相似性達(dá)85.46%，與樹棉(Gossypiumarboreum)氨基酸序列(登錄號：ALJ55536.1)相似性達(dá)81.3%。

2.4 PdKCS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建基于PdKCS氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果表明，PdKCS與可可KCS(XP_007042184.1)聚為一類，親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物聚為同一分支，與單子葉植物聚為不同分支，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。由基因系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，雙子葉植物的KCS已經(jīng)形成與單子葉植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的、相對獨(dú)立的家族，這與目前的研究結(jié)果相吻合。

2.5 熒光定量PCR檢測PdKCS

利用RT-PCR方法和PdKCS的基因特異性引物檢測其在授粉后30、50、70、90 d后種子中的表達(dá)情況(圖5)。使用GraphPad Prism v5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 結(jié)果顯示PdKCS的表達(dá)為雙峰型，在授粉后30 d時(shí)PdKCS的表達(dá)量達(dá)到第1個(gè)高峰，此后表達(dá)水平降低，在50 d后表達(dá)水平再次升高，在授粉后70 dPdKCS表達(dá)水平最高，而在種子發(fā)育后期，即授粉后70～90 d內(nèi)，PdKCS表達(dá)水平降低，不飽和脂肪酸合成量降低，以積累飽和脂肪酸等物質(zhì)以備萌發(fā)所需。

3 結(jié)論與討論

KCS是植物體內(nèi)催化以油酸等單不飽和脂肪酸延長碳鏈產(chǎn)生超長鏈單不飽和脂肪酸生物合成途徑的的關(guān)鍵。本研究將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析后克隆得到的滇牡丹KCS基因序列， 命名為PdKCS，GenBank登錄號為KX524949，包含完整的cDNA開放閱讀框，其開放閱讀框全長1 527 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼含502個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，PdKCS含有KCS蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，且與已報(bào)道的KCS具有高度一致性，表明該蛋白屬于KCS家族蛋白。蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，PdKCS分子式為C2 534H4 008N688O709S23，相對分子質(zhì)量為 56 193.2，理論等電點(diǎn)為9.36，脂肪酸系數(shù)96.1，親水性平均系數(shù)為 -0.026，不穩(wěn)定指數(shù)為40.61，該蛋白為堿性親水不穩(wěn)定蛋白，蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該蛋白為跨膜蛋白，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示PdKCS定位于質(zhì)體膜。

滇牡丹具有生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)、栽培范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此滇牡丹具有極大的引種馴化和育種空間，牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用潛力，因此選育出高單不飽和脂肪酸含量的油用滇牡丹品種并推廣種植，有利于促進(jìn)地區(qū)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。VLCMFA在生物體內(nèi)主要以油酸等單不飽和脂肪酸為底物，在脂肪酰-CoA延長酶復(fù)合體的催化下合成，而脂肪酰-CoA延長酶復(fù)合體中的KCS被認(rèn)為是VLCMFA生物合成途徑中的限速酶，對其深入研究有助于進(jìn)一步了解VLCMFA的合成過程及調(diào)控機(jī)制。因此，PdKCS基因可作為未來滇牡丹油脂高產(chǎn)型新品種培育的調(diào)控研究重點(diǎn)。本研究從滇牡丹中克隆得到KCS基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究它的調(diào)控機(jī)制及獲得種子單不飽和脂肪酸含量高的油用滇牡丹品種，促進(jìn)地區(qū)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值奠定理論基礎(chǔ)。

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