王勝杰,李成,翁新楚*

(1.上海大學 生命科學學院,上海 200444;2.上海大學 環(huán)境與化學工程學院,上海 200444)

可可脂又稱可可白脫,是一種從熱帶木本植物可可樹果實可可豆中榨出的乳黃色硬性天然植物油脂,屬堅果類油脂?？煽芍饕蒷,3-二棕櫚酸-2-油酸甘油酯(POP),1-棕櫚酸2-油酸-3-硬脂酸甘油酯(POSt)和1,3-二硬脂酸-2-油酸甘油酯(StOSt)三種單不飽和甘油三酯組成,三者分別占全部甘油三酯總量的17.5%～22.6%,35.8%～41.4%和22.8%～31.3%[1],這種獨特的甘油三酯組成方式,使得可可脂的熔點范圍極窄,在34℃～38℃(華氏93℃～100℃)之間,正處于人體體溫附近[2],這種獨特的熔融特性可以賦予食品美妙的口感,使其廣泛用作高級糖果巧克力、蛋糕、冰激凌等的原料,市場需求巨大。

隨著人類生活水平的不斷提高與食品工業(yè)的發(fā)展,天然可可脂產(chǎn)量已遠不能滿足市場需求,目前市場上可可脂的替代品主要分為兩類,代可可脂和類可可脂[3]。類可可脂是指甘油三酯組成與可可脂類似的一類替代油脂,可以與天然可可脂以任意比例混溶,且與代可可脂相比,不存在反式脂肪酸的健康隱患[4],是一種高品質(zhì)的可可脂替代品。

目前市場上的類可可脂主要有兩種獲得途徑,酯交換法和調(diào)配法。調(diào)配法指通過富集飽含POP、POSt和StOSt的各種油脂(棕櫚油、雙羅脂、芒果脂、牛油果脂等)[5],然后以一定的比例進行混合,得到類可可脂,由于富含StOSt的油脂本身就稀缺[6],所以該方法具有一定局限性。酯交換法是指通過化學改性或酶法改性,將富含二位油酸型甘油三酯的植物油(如棕櫚油、烏桕脂、茶油等)進行酯交換反應,通過控制反應進行程度,使酯交換產(chǎn)物中甘油三酯種類組成和質(zhì)量比例與天然可可脂一致。另外文獻中也出現(xiàn)了利用微生物生產(chǎn)類可可脂的報道,但是還很不成熟[7]。所有報道中酶促酯交換法因其原料油來源廣泛,發(fā)展前景廣闊,受到越來越多的關(guān)注與研究[4,7-11]。

本實驗從降低生產(chǎn)成本和可行性出發(fā),利用硬脂酸乙酯為甘油三酯的硬脂酸基供體,在無溶劑體系下通過酶促酯交換反應制備類可可脂,整個過程從酯交換反應過程到產(chǎn)物類可可脂的分離都不使用溶劑,具有更高的實用價值,另外本研究首次提出利用硬脂酸乙酯作為甘油三酯的硬脂酸基供體。文獻中有關(guān)無溶劑體系制備類可可脂的研究,如Wang[6]，王靈燕等[4,7-11],都是使用硬脂酸甲酯作為甘油三酯的硬脂酸基供體,但Lahimer，Lewis[12-13]等人報道了硬脂酸甲酯具有誘發(fā)腫瘤的危害性,嚴禁其應用于食品工業(yè)生產(chǎn),故中國國標不允許其作為原料應用于食品工業(yè),而本實驗所用原料硬脂酸乙酯(Ethyl Stearate,ESt),是一種被國標2760[14]允許的食品添加劑,所以本研究具有更高的應用價值,研究成果可應用于工業(yè)化生產(chǎn)。

本實驗主要研究了溫度、底物比、酶添加量等各相關(guān)因素對酯交換反應、類可可脂品質(zhì)的影響,確定了以POMF和硬脂酸乙酯為原料經(jīng)酶促酯交換制類可可脂的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料:棕櫚油中間熔點分提物(POMF),豐益油脂(上海)有限公司贈送;硬脂酸、硬脂酸乙酯(ESt)均為分析純,中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;固定化酶Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM,諾維信(中國)有限公司。

試劑:液相用洗脫劑乙腈、二氯甲烷均為色譜純,薄層分析用正己烷、丙酮、乙醚等均為分析純,購自中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司。

儀器:HPLC1100高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰科技有限公司);TECHCOMP7890F氣相色譜儀(上海天美科學儀器公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 酯交換反應

將一定量的POMF，ESt和硬脂酸加入燒瓶中,添加一定量的固定化脂肪酶,在固定轉(zhuǎn)速的恒溫磁力攪拌器上,一定溫度下反應一定時間得到酯交換產(chǎn)物。

1.2.2 甘油三酯的成分測定

采用高效液相色譜聯(lián)用蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)進行分析。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱,25 m×4.6 mm,5 μm,流動相為乙腈和二氯甲烷(梯度洗脫程序見表1),柱溫20 ℃,流速為1.0 mL/min,進樣體積為5 μL。蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)設置為：漂移管溫度為70 ℃,氮氣流量1.8 L/min,信號放大系數(shù)為1,選擇撞擊器“關(guān)”模式[15]。

1.2.3 反應產(chǎn)物的分離提純

使用減壓蒸餾法除去ESt和硬脂酸[4,16-17],干法分提除去高熔點甘油三酯。

1.2.4 脂肪酸測定

用電子天平稱取20 mg油樣于10 mL具塞試管中,加入2.5 mL正己烷,再加入1 mL甲醇鈉(0.5 mol/L)溶液,室溫下輕搖5 min,然后加入少量無水硫酸鈉,靜置1 h后于2 000～3 000 r/min下離心2～3 min,上層清液用于氣相色譜分析[18]。

采用氣相色譜聯(lián)用氫離子火焰檢測器(GC-FID)分析脂肪酸組成。色譜柱為Agilent DB-5MS,30 m×0.25 mm,0.50 μm,載氣:氮氣,氣化室溫度:250℃,檢測器溫度:260℃,柱溫:180℃(2 min)～240℃(2℃/min)(5 min),進樣量:5 μL[19]。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

1.2.5 評價方法

1.2.5.1 目標酯交換的得率(Ester exchange rate, E)

以反應產(chǎn)物中目標甘油三酯(POP、POSt、StOSt)的生成量與原料POMF中 POP、POSt、StOSt的量之比來表示目標酯交換反應的得率[4,8]。

此公式可以定量反映三種目標甘油三酯在反應過程中量的變化趨勢,式中:[POP]、[POSt]、[SOSt]分別代表相應的甘油三酯酯交換反應后質(zhì)量百分含量,[POP]0、[POSt]0、[StOSt]0分別表示相應的甘油三酯在原料POMF中的質(zhì)量百分含量。

1.2.5.2 ?；灰瞥潭?Acyl migration degree,A)

酰基位移程度=(73.98-反應后甘油三酯Sn-2位油酸質(zhì)量分數(shù))/73.98×100%

式中73.98是原料POMF中Sn-2位油酸質(zhì)量分數(shù)[16-17]。

A值可以定量判斷脂肪酶的1,3位特異性,A值越小,說明脂肪酶特異性越強,所得類可可脂品質(zhì)越高。

1.2.5.3 硬脂酸指數(shù)(Stearic acid index,StI)

其中[POP]、[POSt]、[StOSt]分別表示相應的甘油三酯的質(zhì)量百分含量,可可脂StI為0.52～0.57, 本研究以StI值達到0.54為最佳[4, 11, 20]。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 酶的種類對反應的影響

工業(yè)化生產(chǎn)的1,3位特異性脂肪酶主要有兩種,Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM。無溶劑體系下硬脂酸甲酯與乙酯相比,其酯交換效率更高,可以使脂肪酶是否具有特異性體現(xiàn)得更充分,因此選用甲酯而非乙酯進行脂肪酶在無溶劑體系下的1,3位特異性研究。

在底物質(zhì)量比POMF∶硬脂酸甲酯=1∶1,溫度55℃,轉(zhuǎn)速200 r/min條件下,分別選用固定化酶Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM為催化劑,添加量為底物質(zhì)量10%,反應2 h,運用HPLC-ELSD檢測連續(xù)檢測反應產(chǎn)物中甘油三酯的含量變化,所得液相色譜圖如圖1、圖2所示。

通過圖1,可以清晰地發(fā)現(xiàn)脂肪酶Lipozyme TL IM在無溶劑體系下,其1,3位特異性明顯降低,反應過程會產(chǎn)生較多的高熔點的三飽和甘油三酯,如圖中的PPP、PPSt、PStSt、StStSt等,占總量50%以上,因此不適合在無溶劑體系中作為催化劑制備類可可脂。

Fig.1 Triacylglycerol composition of product determined by HPLC-ELSD analysis when using lipase Lipozyme TL IM圖1 選用脂肪酶Lipozyme TL IM時所得產(chǎn)物中甘油三酯的液相色譜圖

Fig. 2 Triacylglycerol composition of product determined by HPLC-ELSD analysis when using lipase Lipozyme RM IM圖2 選用脂肪酶Lipozyme RM IM時所得產(chǎn)物中甘油三酯組成液相色譜圖

通過圖2我們發(fā)現(xiàn),脂肪酶Lipozyme RM IM的 1,3位特異性和選擇性大大提高,產(chǎn)物中高熔點的三飽和甘油三酯,如PPP、PPSt、PStSt等的量占總量5%左右,較Lipozyme TL IM明顯降低,并且副產(chǎn)物甘一脂和甘二脂的量也明顯降低,甘油三酯的組成比例與可可脂相似。

Fig.3 Ester exchange degree and degree of acyl migration versus the substrate specificity圖3 底物比對反應目標酯交換得率(E)和酰基位移程度變化(A)的影響

綜上所述,在無溶劑體系下,脂肪酶Lipozyme RM IM作為酯交換反應的催化劑優(yōu)勢明顯,故選擇脂肪酶Lipozyme RM IM為催化劑。

2.2 底物比對反應的影響

在反應溫度55℃,反應時間為2 h,轉(zhuǎn)速200 r/min,酶用量為10%條件下,設計底物硬脂酸乙酯(ESt)與棕櫚油中間分提物(POMF)質(zhì)量比分別為1;2;3;4;5;6;7;8;9,探究底物比對反應過程中酰基位移程度(Acyl migration degree,A)和目標酯交換的得率(E)的影響,考察結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可知,當?shù)孜镔|(zhì)量比(硬脂酸乙酯(ESt)/棕櫚油中間分提物(POMF))從1-9時, 目標酯交換程度從4.35%增加到33.76%, 在底物比1-6時, 目標酯交換程度變化迅速,由4.35%增加到30.87%,但繼續(xù)增加硬脂酸乙酯在底物中含量時,在底物比由6升到9的過程中,目標酯交換程度從30.87%增加到33.76%,只增加了2.89%,酯交換程度變化變得較為緩慢。這可能是因為底物比在6左右時,體系已經(jīng)趨于平衡,繼續(xù)增加也不會增加目標甘油三酯POSt、StOSt在體系中的含量[8]。

隨著底物比的增加, ?；灰瞥潭纫苍谳p微變化, 且酰基位移程度與底物比的增加不是線性增加關(guān)系,隨著底物比的增加,?；灰瞥潭仍黾映潭茸兊迷絹碓矫黠@。如底物比在1-5時,?；灰瞥潭茸兓徛?基本在1.56%左右,但當?shù)孜锉仍黾拥?-9時,?；灰瞥潭让黠@增加幅度變快,在底物比為6時還是1.78%,當?shù)孜锉仍黾拥?時,已經(jīng)達到3.23%。所以說底物比不能盲目增大,增加到一定程度后,酰基位移程度會迅速增加。這可能是因為體系中硬脂酸乙酯含量增加到一定程度后,酶的定向酯交換能力受到硬脂酸乙酯的脅迫作用,1,3-位定向酯交換能力降低,導致部分甘油三酯中的2-位脂肪酸也被置換。

Fig.4 Ester exchange degree (E) and saturated triglyceride (SSS) content versus the reaction temperature圖4 反應溫度對目標酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響

為得到高品質(zhì)類可可脂,酯交換程度越大,?；D(zhuǎn)移程度越小越好。?；D(zhuǎn)移程度增高會導致產(chǎn)生過多的三飽和甘油三酯[21],制成巧克力有蠟感,影響類可可脂的口感;酯交換程度較低時產(chǎn)生的POSt、StOSt量不足,類可可脂熔點較低,不適合用于制備巧克力。所以綜合可知,具有較高的酯交換程度和較低的?；灰瞥潭鹊拿复脔ソ粨Q產(chǎn)品是研究的目標[7], 因此選擇底物比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6作為反應底物比較為合適。

2.3 溫度對反應的影響

在底物質(zhì)量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6∶1,反應時間為2 h,轉(zhuǎn)速200 r/min,酶用量為10%條件下,考察反應溫度對產(chǎn)物中底物比對反應目標酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響,結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出,反應溫度從40℃增到55℃,目標酯交換程度基本沒有變化,在35%～37%之間。但當溫度增至60℃以上時,目標甘油三酯POSt、StOSt的酯交換得率E降低明顯,且降低速度隨溫度升高而加快,如在60℃至65℃時,目標酯交換得率從35.89%降到34.78%,降低了1.11%,在反應溫度從65℃升至70℃時,目標酯交換得率從34.78%降到32.57%,降低2.21%。這可能是因為溫度過高時,酶的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有較大的變化,脂肪酶的1,3-位特異性降低[17],產(chǎn)生較多的非目標甘油三酯,如各種三飽和甘油三酯,如PPSt、PStS、StStSt等。所以在反應過程中,應避免溫度過高。

從三飽和甘油三酯(SSS)含量隨溫度變化趨勢可知,隨溫度升高,三飽和甘油三酯含量增加明顯,且其增加趨勢與目標酯交換得率降低趨勢相同,這也在側(cè)面驗證了溫度過高會降低脂肪酶催化劑的1,3-位特異性,使反應的特異性降低,產(chǎn)生較多的非目標甘油三酯的推論。

綜合以上分析,在較低溫度時會得到較高品質(zhì)的類可可脂,但是溫度過低,反應速度會明顯減慢,這不利于酯交換反應過程的成本控制,我們應該在保證酯交換產(chǎn)物品質(zhì)的前提下盡量升高反應溫度,加快反應速度。從反應溫度對目標酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響趨勢我們可以得出,60℃最適于酯交換反應的進行。

Fig. 5 Ester exchange degree (E) and saturated triglyceride (SSS) content versus the amounts of enzyme圖5 酶添加量對目標酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響

2.4 酶添加量對反應影響

在底物質(zhì)量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6∶1,反應時間為2 h,轉(zhuǎn)速200 r/min,反應溫度60℃條件下,考察酶添加量對產(chǎn)物中底物比對反應目標酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響,設計酶添加量分別為底物總質(zhì)量的3%，6%，9%，12%，15%，18%，21%,結(jié)果如圖5。

由圖5可以看出,加酶量低于12%時,目標酯交換程度(E)增加的速度與加酶量基本成線性增長關(guān)系,尤其是從3%增加到9%時,成正相關(guān),酶量每增加1%,目標酯交換程度增加2.6%,這可能是因為在一定的酶添加量范圍內(nèi)(酶在反應體系中含量較小時), 加酶量的增加使得反應底物與催化劑的接觸機會增多, 酯化反應速率也增大, 但是由于加酶量的持續(xù)增加,使反應體系中酶與底物的接觸量趨于飽和,再增加酶含量對反應速度的增加貢獻減弱[8]。所以在酶含量達到15%左右時,再增加酶含量到21%過程中,酯交換程度只從30%增加到了33%。

通過飽和甘油三酯含量變化趨勢圖可知,飽和甘油三酯增加速度與酶的添加量成線性關(guān)系,每增加1%的酶,飽和甘油三酯同樣增加約1%,且變化趨勢在討論的酶添加量范圍內(nèi)都適用。因此為保證高品質(zhì)類可可脂的獲得,酶添加量不可以過高。

考慮到酶在反應過程中的損耗和成本問題,用量越少經(jīng)濟效益越高,綜合以上討論,選擇12%作為加酶量較為合適。

2.5 時間對反應影響

Fig.6 Ester exchange degree (E) and saturated triglyceride (SSS) content versus the time for the reaction圖6 反應時間對目標酯交換得率(E)和三飽和甘油三酯(SSS)含量的影響

Fig.7 StI values versus the time for the reaction圖7 反應時間對硬脂酸指數(shù)(StI)的影響

在底物質(zhì)量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6∶1,轉(zhuǎn)速200 r/min,酶添加量12%,反應溫度60℃條件下,考察反應時間對產(chǎn)物中目標酯交換得率(E)、三飽和甘油三酯(SSS)含量以及硬脂酸指數(shù)(StI)的影響,結(jié)果見圖6、圖7。

由圖6可知,在反應前期,前60 min,目標酯交換產(chǎn)物的含量增加迅速,目標酯交換得率(E)由0增加到了25%左右,這是因為反應開始時底物的濃度較高,反應中副反應、逆反應速度較慢,酶催化酯交換反應的速度很快。隨著反應的進行,底物濃度下降,產(chǎn)物濃度不斷升高,逆反應與副反應增多加快,酶催化反應速度逐漸減小。110 min后,E值趨于穩(wěn)定,也就是說POP、POSt、StOSt的總含量趨于穩(wěn)定。

由圖7可知,StI值在反應開始階段也是增大速度較快,隨著底物的減少,增大速度有所下降并逐漸達到平衡。在約110 min 時,SI值達到0.48,POP、POSt、StOSt之間的相對比例與天然可可脂比較接近,反應達到終點。若反應時間增加,因為StI值不會繼續(xù)增加,但不定向酯交換會越來越多,從SSS的含量趨勢看出,飽和甘油三酯含量會不斷升高,造成類可可脂品質(zhì)降低,不能用作類可可脂。因此,在優(yōu)化條件下,酯交換反應的時間約為110 min。

3 反應產(chǎn)物的分離提純

通過減壓蒸餾, 除去產(chǎn)物中的脂肪酸乙酯,干法分提除去高熔點三飽和甘油三酯,得到類可可脂的三種主要甘油三酯POP、POSt、StOSt的含量在74.93%,其含量分別為:POP 32.01%,POSt 34.79%,StOSt 8.15%,與天然可可脂的甘油三酯組成接近, 雖然POP含量較高,StOSt含量較低,但也可以滿足可可脂組成要求,可作為類可可脂大量添加到可可脂中,對制得巧克力口感不產(chǎn)生明顯影響。

4 結(jié)論

在無溶劑系統(tǒng), 利用1,3-位置特異性固定化脂肪酶催化棕櫚油中間熔點物(POMF)與硬脂酸乙酯進行酯交換反應,經(jīng)過減壓蒸餾和干法分提提純后,可得到與可可脂化學組成和物理性質(zhì)相似的高品質(zhì)類可可脂。通過對酶的種類、底物配比、加酶量、反應溫度、反應時間的研究,從降低成本和提高類可可脂品質(zhì)的角度出發(fā),建立了最優(yōu)的工藝條件。其最佳反應條件是:選用1,3-位特異性脂肪酶Lipozyme RM IM;反應溫度60℃;底物質(zhì)量比硬脂酸乙酯(ESt)∶棕櫚油中間分提物(POMF)=6∶1;加酶量為12%(酶/底物,質(zhì)量百分比);反應時間為110 min。

5 致謝

感謝豐益油脂集團對本實驗的大力支持,感謝侯建平博士對本實驗的指導與幫助,在此表示感謝!

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