陳雪萍，劉世堯，尹能文，荊凌云，魏麗娟，林吶，肖陽，徐新福，李加納，劉列釗

（1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/重慶市油菜工程技術(shù)研究中心，重慶400715；2西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶400715）

0 引言

【研究意義】甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）作為世界性的油料作物，是食用油和蛋白質(zhì)飼料的重要來源，也是加工業(yè)及生物能源的重要原料[1]。纖維組分是植物細(xì)胞壁的主要成分，在油菜莖稈中與植株抗病抗倒伏密切相關(guān)[2-3]，籽粒中纖維組分含量高低直接影響餅粕的飼用價(jià)值[4]，木質(zhì)素單體G/S與油菜抗病存在顯著相關(guān)[5]。植物纖維組分含量測定方法有 Van Soest法、王玉萬法以及高效液相色譜法等[6]，木質(zhì)素單體含量測定方法有酸解法、硫代酸解法和高錳酸鹽氧化法等[7]。這些傳統(tǒng)的化學(xué)測定方法耗時(shí)長、操作過程繁瑣、成本高，不能滿足大批量測定的需求，較為新穎的高效液相色譜法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但設(shè)備昂貴，同樣不適合推廣。近紅外光譜分析技術(shù)（near infrared spectroscopy，NIRS）具有快速、無損、低成本、準(zhǔn)確、無污染的優(yōu)點(diǎn)，無需對樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，就能完成樣品中多種組分的定量測定[8-9]。【前人研究進(jìn)展】近紅外光譜技術(shù)在木本植物及草本植物纖維組分含量檢測中被廣泛應(yīng)用。毛竹、杉木、桉樹、玉米、苜蓿干草、小麥和水稻等植物中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素近紅外模型已經(jīng)建立并用來快速分析其含量[10-15]。近紅外光譜分析技術(shù)在油菜品質(zhì)育種中的應(yīng)用也十分廣泛，其中籽粒品質(zhì)研究居多。20世紀(jì)80年代初，加拿大谷物實(shí)驗(yàn)室利用近紅外光譜成功預(yù)測了油菜籽粒中油分、蛋白質(zhì)和硫苷含量[16-17]。VELASCO等[18]建立了油菜籽粒脂肪酸組分的NIRS分析定標(biāo)方程。FONT等[19-20]先后建立油菜籽粒ADL近紅外模型，然而該模型未能用于其他纖維組分含量的測定。直到2012年，WITTKOP等[21]構(gòu)建了適用于甘藍(lán)型油菜籽粒纖維組分含量分析的NDF、ADF和ADL近紅外模型。單子葉植物的木質(zhì)素由G、S和H型木質(zhì)素單體組成，而雙子葉植物主要是由G型木質(zhì)素單體和S型木質(zhì)素單體組成[22]。國外已開始對木質(zhì)素單體比例近紅外預(yù)測模型可行性進(jìn)行探究，在硬木、軟木、禾本科以及豆科植物中建立了S/G單體比例多變量的化學(xué)預(yù)測模型[23-24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國內(nèi)外已構(gòu)建了預(yù)測含油量、蛋白質(zhì)、硫苷、芥酸、脂肪酸、纖維組分等油菜籽粒品質(zhì)指標(biāo)的NIRS數(shù)學(xué)模型，而油菜莖稈纖維組分含量及木質(zhì)素單體G/S預(yù)測模型尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采集供試材料的近紅外光譜，通過內(nèi)部交叉驗(yàn)證和外部驗(yàn)證研究近紅外光譜法在纖維組分含量、木質(zhì)素單體G/S測定中應(yīng)用的可能性，旨在為甘藍(lán)型油菜抗病、抗倒伏遺傳育種提供參考工具。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 莖稈纖維組分含量供試材料 376份，由200份資源材料和176份重組自交系材料組成。木質(zhì)素單體G/S供試材料105份（資源材料70份，重組自交系35份），分別在2011和2013年種植于重慶市油菜工程技術(shù)研究中心。樣品集分為校正集和檢驗(yàn)集，校正集用于建立模型及模型的內(nèi)部交叉驗(yàn)證，檢驗(yàn)集用于模型的外部驗(yàn)證。本研究根據(jù)光譜學(xué)特征選取化學(xué)成分、含量具有代表性且3次重復(fù)精度較高的103份纖維組分含量和75份木質(zhì)素單體G/S材料作為校正集，分別選取40份、30份化學(xué)值已知樣本作為驗(yàn)證集。

1.1.2 樣品準(zhǔn)備 試驗(yàn)所用材料均為甘藍(lán)型油菜品系，每個(gè)材料隨機(jī)選取健康植株5株，距離地面20 cm處截取長度約30 cm的主莖，曬干后于60℃烘箱中烘干（約48 h），用FW80-1粉碎機(jī)徹底粉碎，充分混勻，收集至自封袋，樣品重約40 g，密閉于干燥器中保存以采集近紅外光譜。

1.2 纖維組分含量及木質(zhì)素單體G/S的化學(xué)測定

纖維組分含量測定參照 VAN SOEST等[25]的方法。

木質(zhì)素單體測定參照ROLANDO等的方法[26]。稱取莖稈風(fēng)干樣品5 mg于15 mL反應(yīng)瓶中，加入1 mL新鮮反應(yīng)液（終濃度為2.5% BF3和10% EtSH溶于二氧雜環(huán)乙烷），100℃條件下反應(yīng)4 h，冰上冷卻5 min，加入200 μL內(nèi)標(biāo)，調(diào)pH至3—4。加入2 mL超純水和1 mL CH2Cl2，渦旋后靜置，收集下層有機(jī)相，用無水 Na2SO4干燥，氮吹儀吹干。揮干物重新溶于CH2Cl2中，加入50 μL嘧啶和100 μL的BSA，25℃靜置4 h，進(jìn)行GC分析，重復(fù)3次，取其平均值。色譜條件：RTX-5MS型彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）；FID檢測器：載氣為高純氦氣，載氣流速為1.19 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度250℃；分流比20:1，進(jìn)樣量2 μL；柱升溫程序：初始溫度為50℃，以 35℃·min-1升溫至 220℃，再以 0.5℃·min-1升溫至230℃，最后以50℃·min-1升溫到280℃，保留7 min。質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度200℃，電子能量70 eV，接口溫度250℃；溶劑延遲5 min。

1.3 近紅外模型的建立和檢驗(yàn)

1.3.1 近紅外掃描光譜的采集 將粉碎的樣品置于室內(nèi)環(huán)境24 h后，裝入小圓型樣品杯壓實(shí)，樣品量約為2.7 g。采用FOSS NIR Systems 5000型近紅外光譜分析儀進(jìn)行吸收光譜的采集，掃描范圍為 1 100—2 498 nm，掃描次數(shù)為64次，分辨率為8 cm-1，為減少儀器波動(dòng)和裝樣對光譜掃描的干擾，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次，用光譜處理軟件合并成平均光譜用于建模。

1.3.2 近紅外檢測模型的構(gòu)建、篩選與檢驗(yàn) 將化學(xué)測定值導(dǎo)入與近紅外檢測儀配套的化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件WinISI Ⅲ，剔除馬氏距離GH（Global H）值大于3.0的超常樣品，將馬氏距離小于0.8的樣品定義為相似樣品，剩余的樣品構(gòu)成定標(biāo)樣品。使用無散射處理（None）、標(biāo)準(zhǔn)正?；?散射處理（SNV+Detrend）、標(biāo)準(zhǔn)正常化處理（standard normal variant，SNV）、去散射處理（Detrend Only）、標(biāo)準(zhǔn)化多元散射校正（Stand and MSC）、加權(quán)散射校正（Weighted MSC）和反相多元離散校正（Inverse MSC）來消除同一樣品多次裝樣掃描結(jié)果產(chǎn)生的偏差。采用主成分回歸法（PCR）、修正偏最小二乘法（MPLS）和偏最小二乘法（PLS）建立校正模型，模型的優(yōu)劣采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證和外部驗(yàn)證評(píng)價(jià)，以校正標(biāo)準(zhǔn)差（SEC）、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差（SECV）、定標(biāo)相關(guān)系數(shù)（RSQ）、交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（1-VR）和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差（SEP）等統(tǒng)計(jì)指標(biāo)對模型進(jìn)行綜合評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 纖維組分含量及木質(zhì)素單體G/S的測定

木質(zhì)素單體 G/S樣品的硫代硫酸解產(chǎn)物經(jīng)GC-MS分析后，依據(jù)H、G和S型木質(zhì)素單體的分子離子峰做定性鑒定。如圖 1所示，定標(biāo)樣品 GM13L和GN280L的木質(zhì)素單體含量差異較為顯著，木質(zhì)素單體組分在50 min內(nèi)完全出峰，分離較為完全。由于H型木質(zhì)素含量極低，本文僅統(tǒng)計(jì)G和S型木質(zhì)素單體含量，其中GM13L單體G/S為0.804，GN280L樣品中單體G/S為 1.180。纖維組分含量和木質(zhì)素單體G/S近紅外模型的校正集和檢驗(yàn)集樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表 1。莖稈材料的 NDF含量范圍在 64.04%—85.34%，平均值75.55%；ADF含量范圍在47.57%—64.02%，平均值 56.97%；ADL含量范圍 6.31%—17.13%，平均值10.98%；木質(zhì)素單體G/S范圍在0.46—1.60，平均值 0.74。定標(biāo)樣品分布范圍較廣，差異明顯，說明具有一定的代表性。

表1 油菜莖稈纖維組分含量和木質(zhì)素單體G/S的測定Table 1 Measurement of stem fiber component content and lignin monomer G/S in rapeseed

2.2 近紅外光譜的采集

近紅外分析光譜的基礎(chǔ)是樣品的化學(xué)組成官能團(tuán)在近紅外區(qū)有特征吸收，吸光度與樣品中成分含量大小有關(guān)。圖 2所示為纖維組分含量和木質(zhì)素單體G/S樣品在1 100—2 498 nm的近紅外漫反射光譜圖，全波長范圍內(nèi)存在多個(gè)吸收峰。在1 450和1 940 nm處是水的特征吸收峰，分別為 O-H鍵一級(jí)倍頻與合頻吸收帶，2 100 nm處吸收峰為O-H和C-O分子鍵二級(jí)倍頻合頻振動(dòng)。不同樣品在近紅外光譜區(qū)吸收光譜特征基本一致，全光譜呈現(xiàn)低中高的變幅范圍，說明樣品主要成分基本相同，但各成分相對含量不同。

圖1 樣品GM13L和GN280L硫代硫酸解產(chǎn)物的主要?dú)庀嗌V峰Fig. 1 Typical chromatograms for thioacidolysis products for GM13L and GN280L

2.3 近紅外模型的建立

當(dāng)回歸方法采用修正偏最小二乘法（MPLS），光譜預(yù)處理分別采用None、SNV Only、Weighted MSC和SNV+Detrend時(shí)，構(gòu)建的近紅外預(yù)測模型其定標(biāo)相關(guān)系數(shù)和交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)最大，校正標(biāo)準(zhǔn)差和交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差最小。由表2可知，纖維組分含量和木質(zhì)素單體G/S近紅外模型內(nèi)部交叉驗(yàn)證效果較好，1-VR分別為 0.864、0.861、0.872和 0.920，SECV分別為1.093、0.932、0.456和0.057，說明模型的預(yù)測準(zhǔn)確性較好。

表2 近紅外模型校正、內(nèi)部交叉驗(yàn)證結(jié)果參數(shù)Table 2 The statistic parameters of calibration, cross-validation for NIRS models

圖2 油菜莖稈纖維組分含量和木質(zhì)素單體G/S的近紅外吸收光譜圖Fig. 2 NIRS spectra of stem fiber component content and lignin monomer G/S in rapeseed

2.4 近紅外模型的檢驗(yàn)

選取未參與定標(biāo)的莖稈樣品對所建纖維組分含量和木質(zhì)素單體G/S模型進(jìn)行驗(yàn)證。如圖3所示，模型的預(yù)測值與化學(xué)值擬合存在較好的線性關(guān)系。相對誤差反映測量結(jié)果偏離真值的實(shí)際大小，由表3可知，相對誤差較小，說明預(yù)測結(jié)果較為準(zhǔn)確。其中RSQ分別為0.837、0.818、0.870和0.935，SEP分別為0.680、0.636、0.348和0.054，表明纖維組分含量和木質(zhì)素單體G/S近紅外模型的預(yù)測準(zhǔn)確度較好，能滿足物質(zhì)品質(zhì)分析中對準(zhǔn)確度的要求。

表3 近紅外模型外部驗(yàn)證結(jié)果Table 3 External validation statistics for NIRS models

3 討論

近紅外光譜分析技術(shù)是一種新型的分析技術(shù)，它具有快速、高效、無損和適合在線分析等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)、制藥和化石等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[27-28]。近紅外光譜主要是含氫基團(tuán)的伸縮振動(dòng)的倍頻吸收譜帶及伸縮振動(dòng)和搖擺振動(dòng)的合頻吸收。植物纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其中纖維素為均一聚糖，半纖維素為兩種或兩種以上糖基的復(fù)合聚糖，都含有大量羥基，而木質(zhì)素的基本結(jié)構(gòu)單元是苯丙烷，苯環(huán)上具有甲氧基和羥基，可見這些成分在近紅外光譜區(qū)都有較強(qiáng)的吸收。本試驗(yàn)中定標(biāo)樣品由資源材料和重組自交系材料組成。其中資源材料間存在較大差異，纖維組分含量及木質(zhì)素單體比例分布范圍較廣，具有廣泛的代表性；為提高模型準(zhǔn)確性和可靠性，選取部分待測重組自交系材料參與建模，符合近紅外建模的需要。本研究采用修正偏最小二乘法（MPLS）、偏最小二乘法（PLS）和主成分回歸（PCR）的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分析建立定標(biāo)模型，將校正模型進(jìn)行對比研究可知，采用修正偏最小二成法建立回歸方程最佳，這與李玉等[29]的研究結(jié)果一致。

圖3 近紅外模型檢驗(yàn)集化學(xué)值與預(yù)測值的關(guān)系Fig. 3 The relationship between the predicted and measured values in validation set for NIRS models

在甘藍(lán)型油菜的研究中，纖維組分含量化學(xué)測定復(fù)雜，準(zhǔn)確的化學(xué)值測定難度較大，因此國內(nèi)外少有關(guān)于纖維組分含量近紅外模型構(gòu)建的報(bào)道。姜訓(xùn)鵬等[30]基于近紅外光譜技術(shù)對不同飼料原料的 NDF和ADF預(yù)測方法進(jìn)行了研究，在近紅外譜區(qū)中觀察到1 450 nm、1 940 nm和2 100 nm處有明顯吸收峰。本試驗(yàn)中在1 100—2 498 nm范圍內(nèi)主要有4個(gè)吸收峰，出峰位置分別為1 450 nm、1 940 nm、2 100 nm和2 274 nm，這與前人研究結(jié)果一致[30-32]。毛竹、杉木、桉樹、玉米、苜蓿干草、小麥和水稻等中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素近紅外模型已被建立并用來快速分析其含量[10-15]。WITTKOP等[21]建立甘藍(lán)型油菜籽粒NDF、ADF和ADL近紅外模型，外部檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)分別為0.62，0.70和0.81，表明近紅外光譜是一種有效檢測油菜纖維組分含量的方法，但精確度還有待提高。本試驗(yàn)構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜莖稈 NDF、ADF、ADL近紅外分析模型，其外部檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)分別為0.837、0.818、0.870，表明所建定標(biāo)模型能快速地預(yù)測莖稈纖維組分含量，但效果并不十分理想。由于試驗(yàn)中中性洗滌過程受殘留雜質(zhì)的影響，過濾比較困難且耗時(shí)較多，而隨著中性洗滌、酸性洗滌和硫酸消化處理，影響建模準(zhǔn)確性的雜質(zhì)被徹底去除，因而ADL近紅外模型精度相對較高，這與陳賢情等[33]研究結(jié)果一致。國內(nèi)外關(guān)于木質(zhì)素單體組分近紅外模型構(gòu)建的研究較少且主要集中在木本植物。ROBINSON等[23]建立白楊木質(zhì)素單體近紅外分析模型，其中S和G型木質(zhì)素單體具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確性，H型木質(zhì)素單體模型預(yù)測能力較差。在此基礎(chǔ)上SUN等[24]建立硬木、軟木、禾本科、豆科植物 S/G單體比例多變量化學(xué)預(yù)測模型，能夠快速準(zhǔn)確的測定木質(zhì)素單體比例。本研究構(gòu)建的甘藍(lán)型油菜莖稈木質(zhì)素單體G/S分析模型，內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)和外部檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)分別為0.920和0.935。

上述研究結(jié)果表明莖稈纖維組分含量和木質(zhì)素單體G/S近紅外模型均可應(yīng)用于后續(xù)的試驗(yàn)和分析，但要使之成為完善成熟的模型仍然需要改進(jìn)。近紅外光譜分析結(jié)果的準(zhǔn)確性受多種因素影響，因此深入了解近紅外光譜分析的各種影響因素，降低負(fù)影響，是今后建立近紅外模型中提高效率減少誤差的關(guān)鍵[34]。另外，試驗(yàn)中使用定標(biāo)樣品不夠多，而中國油菜品種多樣，不具備普遍代表性，今后工作還需不斷補(bǔ)充不同產(chǎn)地和年份的材料，增加樣品品種和數(shù)量，進(jìn)行模型補(bǔ)充校正和升級(jí)優(yōu)化。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用多種光譜預(yù)處理方法、化學(xué)計(jì)量學(xué)方法及內(nèi)部交叉驗(yàn)證，篩選出1-VR值最高和SECV值最低的最佳莖稈纖維組分含量和木質(zhì)素單體G/S近紅外預(yù)測的模型。其交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（1-VR）分別為0.864、0.861、0.872和0.920，用驗(yàn)證集樣品檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其外部檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)（RSQ）分別為 0.837、0.818、0.870和0.935，說明所建模型定標(biāo)效果較好，能快速測量莖稈纖維組分含量和木質(zhì)素單體 G/S，可應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜抗病抗倒伏育種和相關(guān)性狀的遺傳改良。

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