趙久然，李春輝，宋偉，王元東，張如養(yǎng)，王繼東，王鳳格，田紅麗，王蕊

（北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097）

0 引言

【研究意義】玉米在長期的馴化過程中，表型和基因型水平上都形成了極為豐富的遺傳多樣性。這些多樣性的種質(zhì)資源中，很多已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到玉米育種實(shí)踐，對中國玉米育種發(fā)展起到了重要的作用。種質(zhì)資源的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)分析，可以揭示資源的遺傳特性，為育種家選材提供信息，并為后續(xù)的種質(zhì)改良與品種選育提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】中國玉米自交系主要來源于國內(nèi)地方種和外來種質(zhì)[1]。在中國玉米品種改良過程中，發(fā)掘和利用地方種質(zhì)是解決品種適應(yīng)性問題的重要途徑[2]，其中貢獻(xiàn)最大的是以丹340為代表的旅大紅骨種質(zhì)和以黃早四為代表的黃改群（塘四平頭）種質(zhì)，這兩個(gè)本地化雜種優(yōu)勢類群經(jīng)過多年的改良和利用，形成了很多在育種實(shí)踐中廣泛應(yīng)用的骨干自交系。20世紀(jì)50年代后期，美國單交種開始出現(xiàn)并被大面積應(yīng)用，形成了 SS群體、NSS群體和Iodent群體3個(gè)主要的雜種優(yōu)勢類群，并且從20世紀(jì)70—80年代開始引入中國，先后引入少數(shù)優(yōu)良自交系，如Oh43、C103、B73、Mo17等代表系，這些自交系經(jīng)遺傳改良形成了中國雜種優(yōu)勢類群中的蘭卡斯特種質(zhì)和瑞德種質(zhì)[3]。隨著國外商業(yè)化雜交種被大量研制，很多國外優(yōu)秀雜交種的二環(huán)系選系逐漸成為新自交系的主要來源，20世紀(jì)70年代末，從引進(jìn)的國外商業(yè)化雜交種中選育出了掖 8112、鐵7922、沈5003、掖478、鄭58等優(yōu)良自交系，形成了中國的改良瑞德類群[4]。20世紀(jì)70—80年代，以先鋒雜交種P78599選系為代表，選育出齊319、X178等材料，形成了 P群種質(zhì)[5]。近年來，北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心利用外來新種質(zhì)X1132X作為基礎(chǔ)材料，通過在高密度、大群體、變換地、強(qiáng)脅迫等條件下進(jìn)行嚴(yán)格選擇，選育出京724、京725、京464、京MC01等一批優(yōu)良骨干自交系[6]。在此基礎(chǔ)上，以自交系京92和京2416等黃改系作為父本，探索創(chuàng)新了雜種優(yōu)勢模式，組配出京科968（京724×京92）、京科 665（京 725×京 92）、NK718（京 464×京 2416）和京農(nóng)科728（京MC01×京2416）等系列玉米新品種[7]。由于玉米育種實(shí)踐的不斷推進(jìn)、研究材料的差異、分子標(biāo)記類型和數(shù)量的差異等因素的存在，研究者對中國玉米種質(zhì)的遺傳評價(jià)從未停止過。比較前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于研究者利用 RAPD、RFLP、AFLP、SSR和SNP等不同的分子標(biāo)記，對不同玉米種質(zhì)進(jìn)行遺傳評價(jià)和聚類分析[7-13]，因此得出的結(jié)論稍有差異，但一般都會有黃改群、旅大紅骨群、瑞德群、蘭卡斯特群等幾個(gè)種質(zhì)群，有一些研究中劃分出了P群、改良瑞德等類群?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著玉米育種實(shí)踐的不斷推進(jìn)，大量優(yōu)異玉米種質(zhì)被不斷培育和釋放。由于新種質(zhì)不斷被應(yīng)用，有必要更全面地收集目前品種選育中應(yīng)用的種質(zhì)，對已有雜優(yōu)模式和創(chuàng)新雜優(yōu)模式的各類群玉米自交系做更系統(tǒng)的分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究344份玉米自交系包含了當(dāng)前或歷史上玉米育種中應(yīng)用的重要種質(zhì)資源，并收納了美國三大主要雜種優(yōu)勢群的代表系，具有廣泛的代表性。利用覆蓋全基因組的SNP位點(diǎn)，揭示上述重要玉米育種種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，并探討玉米種質(zhì)在改良過程中基因多樣性的變化趨勢，全面闡述中國玉米種質(zhì)的遺傳特征，為玉米育種實(shí)踐提供指導(dǎo)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料由344份玉米自交系組成（電子附表1），包括（1）美國主要雜種優(yōu)勢群瑞德群、蘭卡斯特群、Iodent群；（2）由國內(nèi)地方種質(zhì)發(fā)展出的黃改群和旅大紅骨群；（3）從美國商業(yè)化雜交種選系發(fā)展出的改良瑞德群和 P群；（4）近年來，在中國玉米育種中應(yīng)用的新種質(zhì)。供試自交系能夠反映目前中國玉米生產(chǎn)中應(yīng)用的種質(zhì)資源的遺傳多樣性，具有較為廣泛的代表性和時(shí)效性。

1.2 基因型鑒定

利用北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心研發(fā)的包含3 072個(gè)SNP位點(diǎn)的MaizeSNP3072芯片對供試自交系進(jìn)行基因型分析。每個(gè)樣品取50—60單株葉片形成一個(gè)混池，按照改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA[14]。利用 iScan芯片掃描儀獲取高分辨率的圖片，所得數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入GenomeStudio software v2011.1（Illumina and GoldenGate data）軟件，利用北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心確定的基因分型文件自動分析，獲得每個(gè)樣本的基因型數(shù)據(jù)。從基因型數(shù)據(jù)中過濾掉分型較差的SNP位點(diǎn)和缺失率大于50%的位點(diǎn)，從而得到了2 869個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)將用來進(jìn)一步分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用PowerMarker V3.25軟件[15]計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）、平均等位變異和基因多樣性等。利用PowerMarker 結(jié)合 MEGA 4.0[16]計(jì)算 Nei’s 遺傳距離[17]?；? 869個(gè)均勻分布的高質(zhì)量SNP標(biāo)記，利用Structure V2.3.3[18-19]判斷所有自交系的群體結(jié)構(gòu)。設(shè)置burn-in步長為10 000，MCMC迭代次數(shù)為100 000，對于每一個(gè)K值，分別進(jìn)行16次獨(dú)立的重復(fù)，研究材料的類群個(gè)數(shù)通過 ΔK確定[20]，多次運(yùn)行結(jié)果用CLUMPP軟件[21]整合。利用 Arlequin V3.11[22]計(jì)算AMOVA[23]和類群之間的遺傳分化系數(shù)（Fst）?；诟黝惾鹤越幌档腞ogers（1972）遺傳距離，利用NTSYS pc V2.10y軟件中的Dcenter與Eigen模塊對這些類群進(jìn)行主成分分析，明確各類群自交系的分群特征。

2 結(jié)果

基于2 869個(gè)SNP位點(diǎn)分析的344份玉米種質(zhì)的基因多樣性為0.028—0.646，平均為0.442；PIC值為0.028—0.570，平均為 0.344（表 1）。2 869個(gè) SNP標(biāo)記中，有59.3%（1 702個(gè)）的SNP標(biāo)記基因多樣性處于0.45—0.50，具有較高的多態(tài)性水平。

2.1 群體結(jié)構(gòu)

利用Structure軟件對這些自交系的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)解析。當(dāng)類群數(shù)（K值）在1—10變化時(shí)，對于每個(gè)指定的K值，LnP(D)值隨著K值的增加持續(xù)上升，未出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)（圖1-a）；ΔK值在K=8時(shí)達(dá)到最大值（圖1-b），表明344份自交系可以劃分為8個(gè)類群。基于2 869個(gè)SNP標(biāo)記分析研究材料的遺傳組分在各個(gè)類群中的百分比，當(dāng)以50%類群屬性比率作為劃分依據(jù)時(shí)，344份自交系中有235份（68.3%）被劃分到8個(gè)類群中，而其余的109份（31.7%）則沒有明確的類群歸屬特性（電子附表 1）。根據(jù)各類群所包含材料的系譜等信息，這8個(gè)類群依次確定為旅大紅骨群（Lüda red cob，LRC）、黃改群（Huangzaosi improved lines，HIL）、Iodent群（Iodent，IDT）、蘭卡斯特群（Lancaster，LAN）、X群（X group，X）、改良瑞德群（Improved Reid，IR）、瑞德群（Reid）和P群（P group，P）（圖1-c、表1）。

在8個(gè)類群中，旅大紅骨群、黃改群、Iodent群、蘭卡斯特群、X群、改良瑞德群、瑞德群、P群各自包含21、37、17、23、24、35、39和39份材料，分別占總材料數(shù)的6.1%、10.6%、4.9%、6.7%、7.0%、10.2%、11.3%和11.3%。其中旅大紅骨群、黃改群、蘭卡斯特群、改良瑞德群、瑞德群、P群在前人研究中都有報(bào)道[8-13]，均為玉米育種中常用的雜種優(yōu)勢群；美國三大雜種優(yōu)勢群之一 Iodent種質(zhì)在國內(nèi)應(yīng)用較少，近年有上升的趨勢；X群是指利用外來新種質(zhì)X1132X等作為基礎(chǔ)材料選育而成的自交系群體。

2.2 群體分化及主成分分析

AMOVA結(jié)果表明類群間存在顯著的遺傳變異，占總遺傳變異的38.6%，類群內(nèi)的遺傳變異為58.1%，自交系內(nèi)的為3.3%。比較8個(gè)類群，遺傳距離為0.229—0.514，F(xiàn)st為0.319—0.512（表1）。各類群與X群比較，X群與蘭卡斯特群、黃改群兩者的遺傳距離較大，與瑞德群、Iodent群之間的遺傳距離較小。各類群與黃改群比較，黃改群與X群、蘭卡斯特群、P群的遺傳距離較大，與旅大紅骨群之間的遺傳距離較小。從遺傳分化上來看，類群之間的關(guān)系也存在同樣的趨勢。

圖1 344份自交系的群體結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Clustering analysis of 344 inbred lines via the model-based method

表1 類群間遺傳距離及遺傳分化系數(shù)（Fst）Table 1 Genetic distances as measured by Nei’s distance (top diagonal) and pairwise Fst comparisons (bottom diagonal) between maize inbred groups

主成分分析結(jié)果顯示，比例最高的3個(gè)主成分分別占總遺傳組成的16.88%、15.13%和9.85%，取前3個(gè)主成分利用三維主成分圖解釋類群之間的遺傳關(guān)系。從不同角度觀察三維主成分圖（圖 2），瑞德群與蘭卡斯特群處于三維圖的兩端，在種質(zhì)資源實(shí)際的育種應(yīng)用中，2個(gè)群之間可以形成強(qiáng)雜種優(yōu)勢；黃改群與旅大紅骨群關(guān)系較近，二者均為中國地方種質(zhì)選系、經(jīng)過后續(xù)育種改良形成的群體，因此關(guān)系較近與實(shí)際情況相符；黃改群與X群、改良瑞德和蘭卡斯特群關(guān)系較遠(yuǎn)，黃改群與以上3個(gè)類群均有很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，并在中國形成了很多大面積推廣的品種，如京科968、鄭單958等；X群與Iodent群關(guān)系最近，與黃改群、蘭卡斯特群等遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)。以上結(jié)果和群間遺傳距離有很高的一致性。

圖2 根據(jù)遺傳相似矩陣對344份玉米自交系進(jìn)行主成分分析Fig. 2 Genetic relationship among 344 maize inbred lines revealed by principal coordinate analysis

2.3 群體遺傳多樣性

基于2 869個(gè)SNP位點(diǎn)分析的344份玉米種質(zhì)的基因多樣性為 0.028—0.646，平均為 0.442；PIC值為0.028—0.570，平均為0.344（表2）。不同類群的遺傳多樣性也存在一定差異，其中旅大紅骨群、改良瑞德群、X群和黃改群具有較高的基因多樣性（0.300、0.297、0.284和 0.274）和多態(tài)信息含量（0.243、0.241、0.228和0.226）；而 Iodent、蘭卡斯特和瑞德等國外自交系的基因多樣性（0.233、0.250和 0.247）和多態(tài)信息含量（0.193、0.209和0.202）則較低。

表2 類群的基因多樣性和多態(tài)信息含量Table 2 Summary statistic of genetic diversity for model-based groups

2.4 位點(diǎn)多樣性反應(yīng)育種潛力和改良進(jìn)程

品種產(chǎn)量水平提升的速度和潛力很大程度上取決于擁有種質(zhì)資源的多樣性程度。植物育種要求種質(zhì)要有豐富的遺傳變異[24]，但育種過程通常又會減少遺傳多樣性，隨著商業(yè)育種的進(jìn)行，自交系遺傳基礎(chǔ)狹窄的問題越來越突出，這使得在中國廣泛種植的雜交種遺傳脆弱性增加，大大增加對病蟲害的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面對越來越大的經(jīng)濟(jì)風(fēng)險(xiǎn)。由于群體大小和種質(zhì)改良年代的限制，所有位點(diǎn)并不能全部表現(xiàn)出多態(tài)性，選取各類群的多態(tài)性位點(diǎn)，其遺傳多樣性水平一定程度上反映了種質(zhì)育種潛力。隨著種質(zhì)改良的進(jìn)行，群體遺傳多樣性將會有一定程度的衰減。本研究的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，對各類群的位點(diǎn)遺傳變異程度進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)（圖3），改良?xì)v史較長的美國種質(zhì)類群（蘭卡斯特群、瑞德群、Iodent群）位點(diǎn)平均多態(tài)性水平最低；改良?xì)v史次之的國內(nèi)地方種質(zhì)旅大紅骨群和黃改群位點(diǎn)平均多態(tài)性水平有一定程度的升高；20世紀(jì)70—80年代引入的美國商業(yè)化雜交種選系改良瑞德和 P群，位點(diǎn)平均遺傳多態(tài)性進(jìn)一步升高；近年選育的X群種質(zhì)多態(tài)性最高。以上結(jié)果說明平均位點(diǎn)多態(tài)性和改良年代有很大關(guān)系，改良年代越長，類群遺傳基礎(chǔ)越狹窄，平均位點(diǎn)多態(tài)性越低。

種質(zhì)改良會引入其他血緣材料，在供試自交系中，有很大比例的材料（31.7%）沒有明確的類群歸屬特性，這些材料大多為育種改良過程中產(chǎn)生的中間材料，血緣成分比較復(fù)雜。以占比最高的遺傳組分確定自交系的類群歸屬，當(dāng)分別以20%、35%、50%和65%的遺傳組分作為類群屬性比率的閾值時(shí)，各類群材料趨向于保留最具代表性的種質(zhì)，隨著類群屬性比率閾值的升高，位點(diǎn)基因多樣性有著不同程度的降低（圖4），其中美國種質(zhì)類群（蘭卡斯特群、瑞德群和Iodent群）和國內(nèi)地方種質(zhì)改良系（旅大紅骨群和黃改群）代表性的材料多樣性下降幅度較大，美國商業(yè)化雜交種選系P群和改良瑞德群下降幅度較小，而X群代表性的種質(zhì)則沒有下降趨勢（圖 4）。這種趨勢也和育種改良年代相吻合，育種改良年代越久，群內(nèi)代表性的種質(zhì)多樣性下降程度越明顯，X群由于是近年來選育出來的優(yōu)新種質(zhì)，依然保留了很高的遺傳多樣性，未來還有很高的育種潛力可挖掘。

圖3 8個(gè)類群的多態(tài)性位點(diǎn)基因多樣性Fig. 3 Genetic diversity of polymorphism sites for 8 model-based groups

3 討論

本研究所分析的344份玉米自交系，包含中國當(dāng)前或歷史上玉米生產(chǎn)中應(yīng)用的重要種質(zhì)資源，因?yàn)閄群是美國雜交種選系，所以收納了美國三大主要雜種優(yōu)勢群的代表系。從前人對中國玉米自交系的類群劃分來看，不同研究在類群個(gè)數(shù)和類群之間的關(guān)系上存在一定的差異[7-12]。由于加入了近年來應(yīng)用到育種中的新種質(zhì)（X群種質(zhì)等），類群個(gè)數(shù)和類群之間的關(guān)系和以前的研究有所不同，本研究群體結(jié)構(gòu)分析將X群種質(zhì)獨(dú)立成群，并進(jìn)一步對這一新的種質(zhì)類群進(jìn)行了系統(tǒng)的遺傳分析。本研究引入的X群種質(zhì)，近年在生產(chǎn)實(shí)踐中獲得很大成功，特別是北京農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心堅(jiān)持利用“高大嚴(yán)”選系技術(shù)選育出的京724、京725、京464、京MC01、D9H等一系列X群自交系，與黃改群種質(zhì)京92和京2416組配雜交種，已經(jīng)通過審定并在生產(chǎn)中大面積推廣。X群具有良好的豐產(chǎn)性和抗逆性，同時(shí)也具有熟期合適、子粒脫水速度快等適宜機(jī)械化收獲的優(yōu)良性狀[6]。

縱觀中國玉米品種改良進(jìn)程，品種水平的每一次大幅提高都與關(guān)鍵種質(zhì)的發(fā)掘或引進(jìn)密切相關(guān)。其中，從國外引入的自交系和國外商業(yè)雜交種選系起到了重要的作用，例如瑞德種質(zhì)、蘭卡斯特種質(zhì)、改良瑞德種質(zhì)、P群種質(zhì)和X群種質(zhì)等。把外來種質(zhì)導(dǎo)入國內(nèi)種質(zhì)能有效增加遺傳變異性，并產(chǎn)生更強(qiáng)的雜種優(yōu)勢[25]。中國玉米單交種最主要的雜優(yōu)模式均屬于國內(nèi)種質(zhì)×國外種質(zhì)[26-27]。綜合類群間遺傳距離、Fst和PCA的分析結(jié)果，黃改群與X群、改良瑞德群和蘭卡斯特群遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，這三種雜優(yōu)模式全部為國內(nèi)種質(zhì)×國外種質(zhì)。經(jīng)生產(chǎn)實(shí)踐證明，黃改群可以與X群、改良瑞德群和蘭卡斯特群形成強(qiáng)雜種優(yōu)勢，并已經(jīng)培育出大面積推廣的品種，其中利用X群×黃改群雜優(yōu)模式，育成了京科968、京科665、NK718和京農(nóng)科728等雜交種，此模式與鄭單958、先玉335等中國已有推廣品種的雜優(yōu)模式均不同，是一種新型雜優(yōu)模式。“X群×黃改群”雜優(yōu)模式聚合了X種質(zhì)的高配合力和黃改種質(zhì)的強(qiáng)適應(yīng)性，通過近年來育種實(shí)踐和大面積生產(chǎn)證明，已成為中國玉米生產(chǎn)上快速上升的主要雜優(yōu)模式。

國外種質(zhì)資源可與本地資源形成優(yōu)勢互補(bǔ)，對中國玉米新品種選育作用巨大，但國內(nèi)育種實(shí)踐中應(yīng)用的國外種質(zhì)依然有限，仍有很多玉米種質(zhì)需要育種家去挖掘，以形成更強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，提高玉米產(chǎn)量，滿足世界人口不斷增長對糧食的需求。黎裕等[28]研究表明，到20世紀(jì)末，在45類美國基礎(chǔ)種質(zhì)類型中，有23類種質(zhì)從未應(yīng)用于中國玉米育種，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，與美國近代雜交種相比，中國品種含有較低比例的Iodent、Reid黃馬牙等遺傳組分?？傮w上中國玉米育種利用的基礎(chǔ)種質(zhì)類型仍然偏少，建議引入更多類型的種質(zhì)材料，在中國玉米雜種優(yōu)勢利用模式下，進(jìn)行育種價(jià)值的評估，以應(yīng)用于中國玉米品種改良。主成分分析結(jié)果顯示，X群種質(zhì)與Iodent種質(zhì)遺傳距離相對較近，Iodent種質(zhì)并未得到大規(guī)模的引進(jìn)和利用，因此X群的成功引入和應(yīng)用，拓寬了中國玉米育種實(shí)踐對國外種質(zhì)的利用。

圖4 8個(gè)類群的位點(diǎn)平均基因多樣性和類群屬性比率閾值的關(guān)系Fig. 4 The relationship between genetic diversity of polymorphism sites and group attribute ratios for 8 model-based groups

4 結(jié)論

利用覆蓋玉米全基因組的MaizeSNP3072芯片，對344份代表中國玉米育種種質(zhì)資源基礎(chǔ)的自交系進(jìn)行全基因組掃描。群體結(jié)構(gòu)分析將344份自交系劃分為8個(gè)類群，分別為黃改群、瑞德群、蘭卡斯特群、旅大紅骨群、P群、改良瑞德群、Iodent群和X群，其中 X群與黃改群、蘭卡斯特群遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，與Iodent群遺傳關(guān)系較近。類群的平均位點(diǎn)遺傳多樣性與改良年代關(guān)系較大，X群為近年來創(chuàng)新種質(zhì)，位點(diǎn)平均多樣性最高，可選擇利用潛力大。X群和黃改群形成的京科968系列品種的雜優(yōu)模式“X群×黃改群”為一種新的雜優(yōu)模式，并正在成為中國玉米生產(chǎn)中的主要雜優(yōu)模式。

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