王備芳，陳玉宇，張迎信，劉群恩，孫濱，向小嬌，曹永潤(rùn),2，程式華，曹立勇

（1中國(guó)水稻研究所/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省超級(jí)稻研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江富陽(yáng)311401；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】衰老是植物自發(fā)啟動(dòng)的一個(gè)細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，受遺傳和外界因子（高溫、干旱、病蟲(chóng)害、激素和光照等）的共同調(diào)控[1]。葉片是植物發(fā)育過(guò)程中重要源器官，是植物光合作用的重要場(chǎng)所，為植物提供大部分能量和有機(jī)物質(zhì)。水稻生物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的形成主要依賴(lài)于光合作用，而水稻早衰一般首先發(fā)生在葉片上，水稻葉片早衰一般涉及葉綠體發(fā)育、葉綠素降解、激素和自由基代謝等過(guò)程[2-3]。葉片早衰導(dǎo)致植物光合能力降低，引起作物籽粒灌漿不足、結(jié)實(shí)率下降、千粒重減小等，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量[4]。因此，克隆水稻早衰相關(guān)基因?qū)μ剿髦参镌缢C(jī)制、進(jìn)行水稻遺傳改良具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究人員一般將衰老基因分為兩類(lèi)：一類(lèi)是衰老下調(diào)基因，這類(lèi)基因隨著葉片的衰老表達(dá)受到抑制[5]；第二類(lèi)基因?yàn)樗ダ仙险{(diào)基因，這類(lèi)基因有的在衰老期間被激活，有的在植株發(fā)育早期表達(dá)水平低，但衰老過(guò)程中基因表達(dá)量升高[6-7]。在水稻中已經(jīng)定位和克隆了大量的衰老相關(guān)基因，根據(jù)這些基因參與的代謝途徑與信號(hào)通路劃分，大致可以分為葉綠體發(fā)育和降解的相關(guān)基因NYC1[8]、RLS1[9]、OSPAO[10]、NYC4[11]、NYC3[12]、Osh69[13]、SGR[14]、Sgr[15]和OSRCCR1[10]、蛋白質(zhì)合成和降解相關(guān)基因ospse1[16]、OsSWEET5[17]和PSL2[18]、激素途徑相關(guān)基因OsDos[19]和 OsSAMS1[20]、細(xì)胞程序性死亡相關(guān)基因 SPL28[21]和 SPL33[22]及早衰和其他途徑相關(guān)基因 lms[23]、psd128[24]、RLS3[25]、Osl2[26]、YGL1[2]、Es7(lmes1)[27]、spl32[28]和SPL29[29]等基因。研究報(bào)道已經(jīng)定位的水稻衰老相關(guān)基因有 Psl1[30]、D343[31]、lst[32]、esl5[33]、esl2[34]、D101[31]、yld1[35]、Psl3[36]、Pse(t)[37]、Sms1[38]、esl6[39]、pgl3-t[40]、ES10[41]和 Lad[42]等。目前，已經(jīng)定位和克隆的位于第 5染色體的基因有 OsSAMS1[20]、OsTZF1[43]、OsRab7B3[44]、OsSWEET5[17]、esl3[45]和es-t[46]。葉片衰老是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程：不僅涉及多類(lèi)基因、多種細(xì)胞代謝途徑，而且其過(guò)程極易受內(nèi)外環(huán)境影響，遺傳機(jī)制極其復(fù)雜。研究者們通過(guò)基因克隆和全基因組分析等技術(shù)，已構(gòu)建了植物衰老的部分分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但其機(jī)理仍然不夠清晰?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ES5的表型與目前已克隆的其他早衰基因表型明顯不同，且目標(biāo)區(qū)間內(nèi)未有早衰相關(guān)基因報(bào)道，因此，推測(cè) ES5是一個(gè)新的早衰調(diào)控基因，克隆該基因并對(duì)其功能進(jìn)行研究有利于進(jìn)一步揭示水稻葉片早衰機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】es5是在以嘉禾 212為背景的突變體庫(kù)中篩選到的一份葉片早衰突變體材料，本研究對(duì)該突變體進(jìn)行形態(tài)分析、遺傳分析以及基因精細(xì)定位，為該基因克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用EMS誘變粳稻嘉禾212，從其后代中鑒定出一個(gè)葉片早衰突變體，經(jīng)多代自交后形成突變表型穩(wěn)定的突變體，命名為 es5。以 es5為母本，秈稻中恢8015為父本，配制雜交組合得到 F1，F(xiàn)1自交獲得 F2分離群體，利用 F1和 F2群體進(jìn)行遺傳分析和基因定位。所有材料2015年至2017年種植于中國(guó)水稻研究所杭州實(shí)驗(yàn)基地和海南陵水基地，單株種植，每行 8株，株行距16.5 cm×26.5 cm，管理同大田生產(chǎn)。全生育期觀測(cè)es5與嘉禾212的表型差異。隨機(jī)選取生長(zhǎng)一致的突變體與野生型植株各 10株對(duì)株高、千粒重、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀進(jìn)行考察，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2 細(xì)胞組織化學(xué)染色

1.2.1 二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色 利用二氨基聯(lián)苯胺（diamino benzidine，DAB）染色可以直接觀察植物組織中 H2O2的積累。DAB染色參考 THORDALCHRISTANSEN等[47]的方法。始穗當(dāng)天取es5和嘉禾212倒二葉葉片浸于1 mg·mL-1的DAB染液中，抽真空室溫浸泡10 h后用清水沖洗干凈，然后放入95%乙醇中加熱煮沸50 min脫色至葉片接近白色。脫色后葉片放入95%乙醇繼續(xù)浸泡5 h后拍照。

1.2.2 伊文思藍(lán)染色 伊文思藍(lán)染色可以直接觀察植物組織中的死細(xì)胞情況。伊文思藍(lán)染色參考KONG等[48]和 LI等[49]的方法，始穗當(dāng)天取 es5和嘉禾 212倒二葉葉片浸于0.25%染液中抽真空后浸泡10 h，清水沖洗干凈后放入95%乙醇中加熱煮沸50 min脫色至葉片接近白色。脫色后葉片放入95%乙醇浸泡5 h后拍照。

1.3 凈光合速率和光合色素含量測(cè)定

選擇晴天上午 9：30—11：00，在大田隨機(jī)選取具有代表性的es5和嘉禾212各3株，利用LI-6400XT便攜式光合測(cè)定儀分別對(duì)其劍葉、倒二葉、倒三葉進(jìn)行測(cè)定[50]。光合測(cè)定儀使用紅藍(lán)光源，開(kāi)放氣路。參數(shù)設(shè)置：光量子密度 1 200 μmol·m-2·s-1，流速 500 μmol·s-1。每株每葉重復(fù)3次算平均值作為一次重復(fù)，重復(fù)3次取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

葉綠素含量測(cè)定，參照ARNON[51]和PORRA等[52]的方法。分別取生長(zhǎng)于大田條件下的 es5和嘉禾 212抽穗期劍葉、倒二葉和倒三葉葉片。去除葉片主葉脈后將其剪成0.5 cm左右的小段，分別稱(chēng)重0.1 g左右，放入10.0 mL 80%丙酮中，黑暗條件下浸泡24 h，每隔8 h到10 h震蕩混勻一次以便光合色素充分溶解。每組3次生物學(xué)重復(fù)。將提取液在DU800可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行測(cè)定，以80%丙酮為空白對(duì)照調(diào)零，分別在470、645和663 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值并根據(jù)已有公式計(jì)算光合色素含量。葉綠素a（Chl a）、葉綠素 b（Chl b）計(jì)算公式：Chl a＝(12.7OD663-2.69OD645)×V/W；Chl b＝(22.9OD645-4.68OD663)×V/W；Car＝(1000 OD470×V/W-3.27chl a-104chl b)/198。V表示提取液的體積（10-3L），W表示葉片的重量（g）。

1.4 酶活性和衰老相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定

取es5和嘉禾212抽穗7 d后和21 d后新鮮劍葉，每份稱(chēng)取0.2 g，放入預(yù)冷的研缽中，加入0.1 mmol·L-1的磷酸緩沖液8 mL和少量的石英砂，進(jìn)行冰浴研磨。在4℃ 3 500 r/min離心15 min，取上清液用于超氧化物歧化酶SOD（superoxide dismutase）、可溶性蛋白含量 SP（soluble protein）、丙二醛 MDA（malonaldehyde，MDA）含量測(cè)定。SOD活性、SP含量、MDA含量測(cè)定參照李合生[53]的方法測(cè)定。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

1.5 透射電鏡觀察

選取大田正常生長(zhǎng)的es5和嘉禾212植株，始穗當(dāng)天取es5和嘉禾212倒二葉，去除主脈，剪成約0.5 cm的小段立即置于裝有2.5%戊二醛固定液的50 mL離心管中，抽真空約2 h，使葉片完全沉于管底。4℃固定1 d。脫水、滲透包埋、切塊、染色及電鏡觀察等步驟委托浙江大學(xué)電鏡中心完成。

1.6 遺傳分析

利用 es5與秈稻材料中恢 8015雜交獲得 F1，F(xiàn)1自交獲得分離群體F2。觀察F1和F2的表型，并統(tǒng)計(jì)F2群體中早衰植株與正常植株的分離情況，用SAS軟件進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)。

1.7 基因定位

以es5與秈稻材料中恢8015為親本雜交獲得F1，F(xiàn)1自交得到F2定位群體，取1 280株隱性單株葉片用 CTAB[54]法提取 DNA。隨機(jī)混合 8個(gè)隱性單株DNA構(gòu)建突變體基因混池，利用均勻分布于12條染色體上且在雙親間呈多態(tài)性的 154對(duì)引物分別對(duì)該混池以及雙親進(jìn)行基因型分析篩選連鎖標(biāo)記，隨后用獲得的連鎖標(biāo)記繼續(xù)分析 152個(gè)隱性單株基因型，對(duì)目的基因進(jìn)行初步定位。根據(jù)初定位區(qū)間，從Gramene（http:// ensembl.gramene.org/genome_browser/index.html）上下載該區(qū)間秈稻 93-11和粳稻日本晴的基因組序列，比對(duì)序列尋找插入/缺失（InDel）位點(diǎn)，用 Primer Premiers 5.0軟件開(kāi)發(fā)InDel分子標(biāo)記（表1），用新開(kāi)發(fā)的有多態(tài)標(biāo)記分析全部1 280個(gè)隱性單株基因型對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)定位（引物由杭州擎科生物技術(shù)有限公司合成）。PCR擴(kuò)增采用杭州擎科生物技術(shù)有限公司的 2×Taq PCR Mix，PCR反應(yīng)體系為DNA模板2 μL、2×Taq PCR Mix 5 μL、正向引物 1 μL、反向引物 1 μL 和 ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 4 min；94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后觀察。候選基因分析參照水稻基因組注釋信息數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/）。

1.8 水稻衰老相關(guān)基因表達(dá)量分析

取抽穗期 es5和嘉禾 212的劍葉采用 QIAGEN RNeasy PlantMini試劑盒提取總RNA，提取方法參照說(shuō)明書(shū)。反轉(zhuǎn)錄使用qPCR RT Master Mix試劑盒，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照說(shuō)明書(shū)。內(nèi)參基因?yàn)?Actin（GenBank登錄號(hào)為 NM_001058705），利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析各基因在野生型嘉禾 212及突變體es5中的表達(dá)量，熒光定量PCR反應(yīng)體系為cDNA模板 2 μL、2×SYBR qPCR mix 10 μL、正向引物 0.5 μL、反向引物0.5 μL和ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。以2-△△CT計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。熒光定量PCR所用引物見(jiàn)表1。

表1 基因定位及qRT-PCR所用的引物序列Table 1 Primers used for mapping and qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 es5表型分析

es5是嘉禾212經(jīng)EMS誘變篩選獲得，四葉期前es5表型與嘉禾 212相比無(wú)明顯差異，四葉期時(shí) es5下部葉片葉尖開(kāi)始黃化衰老。同時(shí)，隨著植株的生長(zhǎng)發(fā)育，葉片的衰老面積逐漸增大，至拔節(jié)期中下部葉片衰老黃化（圖1）。對(duì)es5與嘉禾212的農(nóng)藝性狀考察發(fā)現(xiàn)，由于突變體的過(guò)早衰老，其光合能力降低從而影響到整個(gè)植株的生長(zhǎng)發(fā)育。es5的株高、有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀都極顯著下降，分別為嘉禾 212的 62.01%、30.91%、36.01%、90.59%和70.67%（表2）。由此可見(jiàn)葉片早衰嚴(yán)重影響株高、有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率等重要的產(chǎn)量性狀。

2.2 組織化學(xué)分析

葉片衰老伴隨著細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞中大量H2O2等活性氧的積累。伊文斯藍(lán)溶液可以進(jìn)入細(xì)胞膜損傷或者死亡細(xì)胞內(nèi)并呈現(xiàn)出藍(lán)色。因此，伊文思藍(lán)染色是檢測(cè)膜損傷或細(xì)胞死亡的組織化學(xué)指標(biāo)。伊文思藍(lán)染色后，可觀察到es5葉片表現(xiàn)出深藍(lán)色斑點(diǎn)，但嘉禾212葉片染色不明顯（圖2-A），說(shuō)明es5葉片中有更多的壞死細(xì)胞。植物體內(nèi)的H2O2在經(jīng)過(guò)氧化物酶催化釋放出的氧可以與 DAB反應(yīng)呈現(xiàn)紅褐色。DAB染色結(jié)果顯示，es5葉片有大面積的紅褐色沉淀，而嘉禾212幾乎無(wú)褐色沉淀，表明es5葉片中有大量H2O2積累（圖2-B）。

表2 野生型嘉禾212和突變體es5的主要農(nóng)藝性狀比較（均值±標(biāo)準(zhǔn)差，樣本數(shù)=10）Table 2 Comparison of agronomic traits between wild type Jiahe212and mutant es5 (mean ±SD, n=10)

圖1 野生型嘉禾212和突變體es5的表型特征Fig. 1 Phenotypes of wild type Jiahe212 and mutant es5

圖2 野生型嘉禾212和突變體es5葉片的組織化學(xué)染色Fig. 2 Histochemistry staining of leaves of wild type Jiahe212 and mutant es5

2.3 光合色素含量和光合指標(biāo)測(cè)定

通過(guò)對(duì)es5和嘉禾212抽穗期劍葉、倒二葉、倒三葉的葉綠素a含量、葉綠素b含量、類(lèi)胡蘿卜素含量和凈光合速率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，相較于嘉禾212，es5劍葉、倒二葉及倒三葉的葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素含量和凈光合速率均有所下降，部分指標(biāo)差異極顯著（圖 3）。表明es5葉片的提前衰老導(dǎo)致葉片中光合色素含量下降，光合速率極顯著降低，嚴(yán)重影響了水稻植株的光合能力。

2.4 酶活性和衰老相關(guān)參數(shù)的測(cè)量

超氧化物歧化酶（SOD）是一種活性氧清除劑，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的 SOD活性降低時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧不能得到及時(shí)清除，導(dǎo)致活性氧在細(xì)胞內(nèi)大量積累，最終引起細(xì)胞膜脂過(guò)氧化。丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，丙二醛含量越高代表細(xì)胞膜脂的過(guò)氧化程度越高，是衰老的重要指標(biāo)。植物葉片衰老還引起蛋白含量的降低，蛋白質(zhì)被分解成多肽和氨基酸進(jìn)而被轉(zhuǎn)運(yùn)到植物幼嫩組織中。取抽穗前期（7 d）和抽穗后期（21 d）es5和嘉禾212劍葉測(cè)定SOD活性、MDA含量和可溶性蛋白含量。發(fā)現(xiàn)從抽穗前期（7 d）到抽穗后期（21 d），es5葉片中的SOD活性均顯著高于嘉禾212中SOD活性（圖4-A）；MDA含量在抽穗前期差異不顯著，在抽穗后期es5中MDA含量顯著高于嘉禾212中MDA含量（圖4-B）；抽穗前期和抽穗后期es5葉片中可溶性蛋白含量均極顯著低于嘉禾212中可溶性蛋白含量。綜上所述，es5衰老速度高于嘉禾212（圖4-C）。

2.5 es5葉綠體降解加速

圖3 野生型嘉禾212和突變體es5抽穗期劍葉（F），倒二葉（S），倒三葉（T）葉片的凈光合速率和光合色素含量（均值±標(biāo)準(zhǔn)差，樣本數(shù)=3）Fig. 3 Net photosynthetic rate and photosynthetic pigments content of the wild type Jiahe212 and mutant es5 in the flag leaf(F), the second upper leaf (S) and the third upper leaf (T) at heading stage (means ± SD, n=3)

圖4 抽穗期野生型嘉禾212和突變體es5的生理學(xué)特征Fig. 4 Physiological characters of wild type Jiahe212 and mutant es5 at heading stage

表3 es5的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of es5

利用透射電鏡觀察es5和嘉禾212植株葉綠體超微結(jié)構(gòu)，取抽穗當(dāng)天es5和嘉禾212倒二葉進(jìn)行透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，嘉禾212葉綠體呈紡錘狀，葉綠體內(nèi)類(lèi)囊體排列整齊，片層結(jié)構(gòu)清晰，基粒堆疊致密。而es5衰老部位葉肉細(xì)胞則發(fā)生了顯著的變化，整個(gè)細(xì)胞死亡特征明顯，其細(xì)胞質(zhì)溶解，葉綠體結(jié)構(gòu)異常，葉綠體膜溶解，基粒模糊，基質(zhì)片層疏松，類(lèi)囊體發(fā)育異常，淀粉顆粒增多（圖 5）。說(shuō)明es5衰老部位葉肉細(xì)胞葉綠體已經(jīng)發(fā)生降解，不能正常進(jìn)行光合作用。

2.6 es5遺傳分析

將es5和秈稻中恢8015雜交，F(xiàn)1植株葉片為正常表型。F2群體中出現(xiàn)性狀分離。在隨機(jī)挑選的 250棵F2單株中，68株表現(xiàn)早衰表型，182株表現(xiàn)正常。經(jīng)卡方（χ2）測(cè)驗(yàn)，符合 3∶1 的分離比 χ2=0.65＜χ20.05= 3.84（表3）。表明es5早衰性狀由一對(duì)核隱性基因控制。

圖5 野生型嘉禾212和突變體es5葉片的透射電鏡觀察Fig. 5 Transmission electron microscopy (TEM) analysis of chloroplast in wild type Jiahe212 and mutant es5

2.7 目的基因定位

通過(guò)es5和秈稻中恢8015衍生出的F2群體來(lái)用于es5的初定位，選用均勻分布在12條染色體上且在嘉禾212和中恢8015間呈多態(tài)的154對(duì)SSR和InDel標(biāo)記，分析突變體混池基因型，結(jié)果表明，位于第 5染色體長(zhǎng)臂的標(biāo)記RM6841和RM5907與早衰表型連鎖。從Gramene下載更多的SSR標(biāo)記，通過(guò)分析152株隱性植株的基因型，將es5初步定位在RM3486和RM3664兩對(duì)標(biāo)記之間（圖6-A）。為精細(xì)定位ES5，在RM3486和RM3664之間，新開(kāi)發(fā)2對(duì)多態(tài)性好的InDel引物（表 1），運(yùn)用新標(biāo)記和已有 SSR標(biāo)記進(jìn)一步分析1 280個(gè)隱性單株基因型，通過(guò)連鎖分析，將目的基因定位于標(biāo)記4BF-10和RM3664之間的52.7 kb物理區(qū)間內(nèi)（圖6-B）。參考水稻基因組注釋計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rapdb.dna.affrc.go.jp），該區(qū)間內(nèi)共包含8個(gè)候選基因。對(duì)候選基因的確定還有待進(jìn)一步的序列分析。

2.8 衰老相關(guān)基因的表達(dá)量分析

在植物衰老過(guò)程中，植物體內(nèi)與衰老相關(guān)的基因會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。利用qRT-PCR分析抽穗期es5和嘉禾212中衰老基因的表達(dá)量。Osh36[55]編碼一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)移酶與自然葉片衰老有關(guān)；Osh69[13]和OsI85[55]分別編碼種子休眠蛋白和異檸檬酸裂解酶，是水稻葉片衰老的標(biāo)志基因；SGR[14]和RCCR1[10]分別編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽蛋白和紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶與葉綠體降解相關(guān)。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，es5中衰老相關(guān)基因Osh36、Osh69、OsI85和RCCR1極顯著上調(diào)（圖7），2個(gè)衰老的標(biāo)志基因Osh69和OsI85表達(dá)量分別上調(diào)12.7和36.6倍。同時(shí)葉綠素降解相關(guān)基因SGR也顯著上調(diào)（圖7）。

圖6 es5的精細(xì)定位Fig. 6 Fine mapping of es5

圖7 衰老及光合作用相關(guān)基因表達(dá)量分析Fig. 7 qRT-PCR analysis of senescence and photosynthesis associated genes

3 討論

目前，在水稻中已經(jīng)鑒定出 150多個(gè)葉色以及衰老相關(guān)基因，但被克隆的僅有50多個(gè)。已被定位的早衰相關(guān)基因在除第1、第8和第12染色體外的其他9條染色體上均有分布，其中在第5染色體上主要有ES-T和esl3（表4）。根據(jù)定位結(jié)果顯示，es5與目前報(bào)道的衰老基因均不等位，為一個(gè)新的早衰基因。

本研究中的es5四葉期下部葉片就開(kāi)始黃化，抽穗期倒二葉、倒三葉衰老現(xiàn)象嚴(yán)重，倒四葉片死亡。其表型與已報(bào)道的早衰突變體psl1、psl2、psl3、pse(t)、esl2、es-t、esl3和lad均有明顯的差別。psl1形態(tài)特點(diǎn)是自苗期葉片就開(kāi)始變黃衰老，葉片全展后葉尖就開(kāi)始枯萎；psl2在播種后6—8周出現(xiàn)早衰表型，抽穗時(shí)衰老最明顯，大部分葉片黃化死亡；psl3是從第 5葉葉尖開(kāi)始黃化衰老，6葉期后黃化面積逐漸增大并向葉片中部擴(kuò)展；pse(t)的特點(diǎn)是在苗期無(wú)表型，抽穗期首先在老葉上出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，接著整片葉子快速黃化衰老，之后葉鞘和上部葉片也開(kāi)始黃化衰老，至乳熟期大部分葉片衰老枯萎；esl2孕穗期開(kāi)始才從葉尖和葉緣部逐漸黃化衰老；es-t在苗期葉片就開(kāi)始變黃，且有銹斑出現(xiàn)，其中，葉緣和葉尖表型更嚴(yán)重。esl3三葉期前表型不明顯，三葉期后葉片發(fā)育完全后新葉葉尖表現(xiàn)褐化死亡，該性狀一直持續(xù)到成熟；lad葉尖在第5片葉抽出前呈正常狀態(tài)，當(dāng)?shù)?片葉完全抽出之后前5葉的葉尖變黃并最終枯死；此后新葉在完全抽出后葉尖也逐漸變黃并枯死。本研究中es5葉片中SOD活力和MDA含量較野生型顯著性升高，可溶性蛋白含量較野生型顯著性降低。es5葉片中促進(jìn)衰老的基因Osh36、Osh69、OsI85、RCCR1和葉綠素降解相關(guān)基因SGR表達(dá)量極顯著上調(diào)。es5葉片中葉綠體降解加速，野生型葉綠體結(jié)構(gòu)正常。推測(cè)由于ES5的突變致使早衰相關(guān)基因和葉綠體降解相關(guān)基因被激活高量表達(dá)導(dǎo)致突變體內(nèi)葉綠體降解加速，光合色素含量降低，光合能力下降，導(dǎo)致es5葉片黃化植株過(guò)早衰老，產(chǎn)量下降。

表4 水稻中已定位早衰相關(guān)基因在染色體上的位置Table 4 The location of genes about leaf senescence on chromosomes in rice

遺傳分析和基因精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)es5受單隱性核基因控制，該基因位于第 5染色體標(biāo)記 4BF-10和RM3664之間約52.7 kb區(qū)域內(nèi)，該定位區(qū)間包含8個(gè)ORFs。ORF1 和 ORF3 編碼轉(zhuǎn)座子蛋白；ORF2、ORF4、ORF5和ORF6編碼未知表達(dá)蛋白；ORF7編碼生長(zhǎng)素響應(yīng) Aux/IAA家族基因OsIAA19；ORF8編碼糖基轉(zhuǎn)移酶43家族蛋白。生長(zhǎng)素可以直接延緩植物的衰老[56]。糖基化修飾可以改變生物活性、水溶性、在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)特性、亞細(xì)胞定位以及與受體的識(shí)別與結(jié)合的特性，而且還能降低或消除內(nèi)源和外源物質(zhì)的毒性。而糖基轉(zhuǎn)移酶是一種專(zhuān)門(mén)進(jìn)行糖基化修飾的酶類(lèi)。因此，糖基轉(zhuǎn)移酶在調(diào)節(jié)植物的代謝、維持植物體的正常生長(zhǎng)等方面具有重要的意義[57]。將ORF7或ORF8暫定為可能的候選基因，優(yōu)先對(duì)其進(jìn)行序列分析。

自然衰老過(guò)程中伴隨各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物成分的變化。在衰老過(guò)程中植物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)再分配到生殖器官等代謝旺盛的部位，便于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的再利用，有利于植物的生長(zhǎng)繁殖，是植物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性。正常的、適時(shí)的衰老對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育而言是有利的，但過(guò)早衰老會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降[58]。因此分離更多的水稻早衰相關(guān)基因并闡明其生物學(xué)功能，從而有效促進(jìn)水稻葉片衰老調(diào)控分子機(jī)制的研究，對(duì)于穩(wěn)定水稻產(chǎn)量提高水稻品質(zhì)具有重要意義。本研究已完成對(duì) ES5的精細(xì)定位，為克隆該基因以及深入研究該基因的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

es5表現(xiàn)出光合色素含量降低，光合能力下降，植株變矮，單株有效分蘗數(shù)減少，千粒重和結(jié)實(shí)率等顯著下降。es5受1對(duì)隱性核基因控制，并將該基因定位在第 5染色體介于標(biāo)記 4BF-10和 RM3664之間52.7 kb的區(qū)域內(nèi)。推測(cè)ES5是一個(gè)新的早衰調(diào)控基因。

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