何純剛 黃沁園 鐘世彪 陳利生 肖和衛(wèi) 李 雷

（1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 廣西南寧 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院 廣西南寧 530021；3廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院 廣西南寧 530021；4廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530021）

目前公認“正常黏膜—結(jié)直腸腺瘤—結(jié)直腸癌”是散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)病機制之一，甲基化（包括高甲基化及低甲基化）是腫瘤中表觀遺傳學(xué)改變最常見的類型之一，目前研究最深入的是抑癌基因啟動子甲基化的研究，但關(guān)于基因低甲基化在結(jié)直腸腺瘤中的作用機制尚未完全明確。因此，本研究采用全基因組甲基化芯片分析結(jié)直腸腺瘤低甲基化譜，并尋找基因低甲基化標記物，為進一步研究結(jié)直腸腺瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制及早期診斷提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究中，組織標本源自2013年1月至2014年12月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科及廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院住院患者，共收集29例標本：包括9例內(nèi)鏡下切除的結(jié)直腸腺瘤標本（直徑≥2 cm）及20例結(jié)直腸黏膜標本（經(jīng)腸鏡排除炎癥性腸疾病、癌前病變及癌）作正常對照組。在9例腺瘤患者中男性4例，女性5例，中位年齡53歲；部位：結(jié)腸7例，直腸2例；病理類型：絨毛狀腺瘤2例，管狀絨毛狀腺瘤3例，管狀腺瘤4例，均無癌變。收集的標本直接放入-80℃冰箱中保存。本研究收集標本已獲得患者同意，研究獲得廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 DNA提取及亞硫酸氫鹽修飾轉(zhuǎn)化 組織DNA的提取按照 QIAamp DNA mini kit（Qiagen,Hidden,Germany）試劑盒說明書進行，提取的DNA質(zhì)量檢測、定量、DNA亞硫酸氫鹽修飾轉(zhuǎn)化按照Zymo EZ DNA Methylation kit（Zymo Research,CA,USA）說明書進行。

1.3 450K甲基化芯片分析 所有經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA樣本均采用450K甲基化芯片（Illumina,San Diego,Ca,USA）按操作說明進行。每個樣本重復(fù)三次，芯片用Illumina HiScan SQ scanner進行掃描。

1.4 統(tǒng)計分析

1.4.1 結(jié)直腸腺瘤甲基化芯片原始數(shù)據(jù)處理及差異低甲基化譜分析 采用genomestudio（genomestudio software 2011.1，Illumina）軟件進行芯片原始數(shù)據(jù)的提取、質(zhì)量控制分析、校正。每個CpG位點的甲基化程度用 AVG_Beta值（數(shù)值為 0～1）來表示，Δβ代表腺瘤與正常對照組CpG位點的差異甲基化程度（數(shù)值為-1～1），Δβ大于0.17視為高甲基化，小于-0.17視為低甲基化，Δβ絕對值越大，其差異甲基化程度越高。對篩選出來的低甲基化標記物在基因組中的分布進行描述性分析。

1.4.2 差異低甲基化基因的功能分析 GO包括三大功能注釋類別：生物過程、細胞成分、分子功能。采用DAVID在線分析的方法（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）［1-2］對差異低甲基化基因進行GO分析，統(tǒng)計每個GO條目中所包括的差異基因個數(shù)，并用統(tǒng)計檢驗的方法計算每個GO條目中差異基因富集的顯著性。計算的結(jié)果會返回一個富集顯著性的P值，P＜0.05表示差異基因在該GO條目中出現(xiàn)了富集。通過KEGG_pathyway分析，統(tǒng)計每個信號通路條目中所包括的差異基因個數(shù)，并用統(tǒng)計檢驗的方法計算每個信號通路條目中差異基因富集的顯著性，P＜0.05提示差異基因在該信號通路中出現(xiàn)富集，可能參與了該信號通路的作用。

1.4.3 差異低甲基化基因標記物的篩選 為從龐大的差異甲基化位點中篩選出具有可重復(fù)性研究、具有一定功能及診斷價值的差異低甲基化基因作為標記物，參照文獻［3］，結(jié)合本實驗甲基化芯片數(shù)據(jù)，按如下條件篩選低甲基化基因標記物：腺瘤與正常組差異甲基化程度Δβ≤-0.4，腺瘤組中平均甲基化水平β≤0.2，標記物基因位于GO分析及KEGG_pathyway分析任意前三位條目之一。

2 結(jié) 果

圖1 低甲基化標記物在CpG島相關(guān)區(qū)域及基因結(jié)構(gòu)中的分布

表1 結(jié)直腸腺瘤中差異低甲基化基因GO分析

2.1 結(jié)直腸腺瘤差異低甲基化譜分析結(jié)果 在本研究中，450K甲基化芯片共可檢測的甲基化位點為485 577個，根據(jù)|Δβ|≥0.17視為差異甲基化標記物，整個基因組中共發(fā)現(xiàn)65 535（13.6%）個差異甲基化位點，40 071（61.14%）個為低甲基化位點，其中66.3%的低甲基化位點主要分布于CpG島相關(guān)區(qū)域以外的區(qū)域 （Open sea）（圖1-A），在基因結(jié)構(gòu)分析中，40%、37%、33%的低甲基化位點分別分布于基因間隔區(qū)域（Intergenic region）、基因內(nèi)區(qū)域（Body 及3'UTR） 及啟動子區(qū) （包括TSS1500，TSS200，5'UTR及 1stExon）（圖 1-B）。

2.2 GO分析及KEGG_pathyway分析結(jié)果 考慮|Δβ|≥0.17篩選出來的差異甲基化標記物較多，本研究參照文獻［4］進一步設(shè)Δβ≤-0.4，在腺瘤組織中共發(fā)現(xiàn)912個差異低甲基化標記物，其中包含584個差異低甲基化基因。對上述基因進行GO分析結(jié)果提示在生物進程功能注釋類別中，差異低甲基化基因主要富集前3位條目的有細胞粘附、與化學(xué)刺激有關(guān)的嗅覺覺察及化學(xué)突觸傳遞；在分子功能注釋類別中，差異低甲基化基因主要富集前3位條目的有鈣離子結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體活性及嗅覺受體活性；在細胞成分注釋類別中，主要富集前三位條目的有質(zhì)膜、蛋白質(zhì)的細胞外基質(zhì)及質(zhì)膜的整體組成部分，見表1。KEGG_pathyway分析結(jié)果表明，差異低甲基化基因主要主要在嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆行內(nèi)源性大麻素信號、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中出現(xiàn)富集，見表2。

表2 結(jié)直腸腺瘤中差異低甲基化基因KEGG_pathyway分析

表3 篩選出來的低甲基化基因標記物

2.3 低甲基化基因標記物的篩選 在Δβ≤-0.4的912個差異低甲基化CpG位點中，考慮到具有診斷價值的標記物需要滿足|Δβ|盡可能大，腺瘤組β盡可能最小，同時基因標記物需要具有一定功能或可能參與某些信號通路?；谏鲜鰲l件，我們進一步按腺瘤組中平均β≤0.2共篩選出28個低甲基化基因；具有GO、KEGG_pathyway分析符合任何前3個條目之一的標記物一共有15個基因，分別是：SMAD3、DNAJB6、ATXN1、TCF15、TNR、GABRR2、EXD3、AKAP13、ARNT2、RAPGEF4、IL5RA、SPTBN5、INPP5A、ANK2、PRDM16，見表 3。

3 討 論

研究表明，結(jié)直腸癌是發(fā)達國家最常見的惡性腫瘤之一，中國結(jié)直腸癌新發(fā)病例占全球的18.6%，結(jié)直腸癌居中國人群惡性腫瘤死因順位第五位［4］。在過去數(shù)十年，研究發(fā)現(xiàn)一系列的基因遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［3］。研究表明，“正常黏膜—腺瘤—癌—癌轉(zhuǎn)移”是散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的主要途徑，同時在這個過程中發(fā)生一系列基因及表觀遺傳學(xué)改變事件累積作用的結(jié)果［5-6］。研究表明，DNA異常甲基化 （包括高甲基化及低甲基化狀態(tài)）在結(jié)直腸腺瘤中廣泛存在，隨著眾多異常甲基化基因被發(fā)現(xiàn)，表明基因表觀遺傳的改變作為頻發(fā)的早期事件可能影響了結(jié)直腸腺瘤向癌轉(zhuǎn)變，同時也可能成為早期診斷的標記物［5,7-9］。然而傳統(tǒng)的研究方法主要局限于單個基因的發(fā)現(xiàn)及檢測，無法了解整個基因組的甲基化狀態(tài)，目前對于結(jié)直腸腺瘤及癌的發(fā)病機制、早期診斷、風(fēng)險評估均存在不足［3］。近年來研究表明，甲基化芯片 （Illumina Infinium 450K）檢測技術(shù)是一種基于全基因組甲基化檢測分析方法，其檢測功能強大，具有高通量、高靈敏度的特點，檢測范圍涵蓋了485 000個CpG位點，同時具有精確度高、重復(fù)性好的優(yōu)點［10-11］。目前已有文獻報道采用Illumina Infinium 450K甲基化芯片在結(jié)直腸腺瘤及癌中檢測，獲得了許多新的甲基化標記物［3］。

目前對于甲基化在腫瘤中的研究最深入的是抑癌基因啟動子甲基化的研究，啟動子高甲基化可以影響很多種細胞通路，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［11］。雖然有文獻報道在散發(fā)性結(jié)直腸癌及腺瘤組織中廣泛觀察到基因組DNA低甲基化［3］、低甲基化與預(yù)后不良有關(guān)［13］，在基因CpG島DNA低甲基化可能誘導(dǎo)基因異常表達并有助于在結(jié)直腸癌中獲得侵襲性的腫瘤行為［14］，但對于低甲基化在結(jié)直腸腺瘤向癌轉(zhuǎn)變過程中的作用機制目前研究仍甚少。

本研究通過芯片數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)的分析方法，重點分析了結(jié)直腸腺瘤中的低甲基譜，與正常組對比，共發(fā)現(xiàn)40 071個差異低甲基化位點，主要分布于CpG島以外的區(qū)域或位于非啟動子區(qū)，與文獻報道相符［4］，提示異常低甲基化狀態(tài)可能參與了結(jié)直腸腺瘤的發(fā)病過程。將腺瘤與正常組比較的差異甲基化程度Δβ≤-0.4后，發(fā)現(xiàn)912個差異低甲基化位點，涵蓋584個基因，對上述基因進行GO分析、KEGG_pathyway分析發(fā)現(xiàn)，差異低甲基化基因涵蓋了許多不同的功能群落（見表1），并在多種信號通路中出現(xiàn)富集（見表2），提示在腺瘤的發(fā)生及發(fā)展中，有多種類型的基因參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，但具體機制有待進一步深入研究。本實驗進一步篩選出了15個具有功能的低甲基化相關(guān)基因作為標記物，其在腺瘤組中甲基化程度非常低，在正常組中甲基化程度較高（見表3），提示有可能作為甲基化標記物用于結(jié)直腸腺瘤的早期診斷。

綜上所述，使用全基因組甲基化芯片來探究結(jié)直腸腺瘤相關(guān)的新型甲基化標志物，可能有助于提高對異常低甲基化和其分子機制在結(jié)直腸腺瘤發(fā)病機制中的作用的理解。下一步我們對其差異甲基化水平將采用焦磷酸測序的方法在結(jié)直腸腺瘤組織中做進一步鑒定，為結(jié)直腸腺瘤發(fā)病機制的研究及早期診斷提供更多線索。

［1］HUANG DA W，SHERMAN B T，LEMPICKI R A.Bioinformatics enrichment tools:paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists［J］.Nucleic acids research， 2009，37（1）:1-13.

［2］HUANG DA W，SHERMAN B T，LEMPICKI R A.Systematic andintegrativeanalysisoflargegenelistsusingDAVIDbioinformatics resources［J］.Nature protocols，2009;4（1）:44-57.

［3］NAUMOVVA，GENEROZOVEV，ZAHARJEVSKAYANB，et al.Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 Bead-Chips［J］.Epigenetics，2013，8（9）:921-934.

［4］馮雅靖，王寧，方利文，等.1990年與2013年中國人群結(jié)直腸癌疾病負擔分析［J］.中華流行病學(xué)雜志，2016，37（6）:768-772.

［5］ALEXANDER M，BURCH J B，STECK S E，et al.Casecontrol study of candidate gene methylation and adenomatouspolypformation［J］.Internationaljournalofcolorectaldisease， 2017，32（2）:183-192.

［6］CARETHERS J M， JUNG B H.Genetics and Genetic Biomar-kers in Sporadic Colorectal Cancer［J］.Gastroenterology，2015，149（5）:1177-1190.

［7］LEE B B， LEE E J， JUNG E N， et al.Aberrant methylation of APC， MGMT， RASSF2A， and Wif-1 genes in plasma as a biomarker for early detection of colorectal cancer［J］.Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research，2009，15 （19）:6185-6191.

［8］LAO V V，GRADY W M.Epigenetics and colorectal cancer［J］.Nature reviews Gastroenterology&hepatology， 2011，8（12）:686-700.

［9］HE C G， HUANG Q Y， CHEN L S，et al.p33ING1b methylati-on in fecal DNA as a molecular screening tool for colorectal cancer and precancerous lesions ［J］.Oncol Lett，2014，7（5）:1639-1644.

［10］DEDEURWAERDER S， DEFRANCE M， CALONNE E，et al.Evaluation of the Infinium Methylation 450K technology［J］.Epigenomics，2011，3（6）:771-784.

［10］SANDOVAL J， HEYN H， MORAN S， et al.Validation of a DNA methylation microarray for 450，000 CpG sites in the human genome［J］.Epigenetics，2011，6（6）:692-702.

［12］陳偉，王磊，葉俊文，等.基于生物芯片檢測結(jié)直腸癌相關(guān)基因的甲基化［J］.中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2014，35（6）:920-924.

［13］OGINO S，NOSHO K，MEYERHARDT J A，et al.Cohort study of fatty acid synthase expression and patient survival in colon cancer［J］.Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology，2008，26（35）:5713-5720.

［14］KATO K， MAESAWA C， ITABASHI T， et al.DNA hypomethylation at the CpG island is involved in aberrant expression of the L1 cell adhesion molecule gene in colorectal cancer［J］.Int J Oncol，2009，35（3）:467-476.