雷鋒杰，張愛華，傅俊范，王壯，張連學(xué)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

在自然條件下，植物無法通過主動移動逃避不利環(huán)境。然而，植物與其他生物之間其實是一種“共同進化”“互為主客體”的關(guān)系[1]?，F(xiàn)有證據(jù)足以證明，植物次生代謝物質(zhì)是植物化學(xué)防御的重要武器[2-4]。次生代謝產(chǎn)物在提高植物抗病能力方面起著舉足輕重的作用，如糖苷生物堿在植物的新生芽、花、嫩葉、未成熟的果實中含量高，可保護這些重要器官免受其他生物的攻擊[5]。

皂苷廣泛存在于植物體內(nèi)，是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，具有殺菌、化感、殺病毒、殺蟲等多種生物活性，在植物抵御病蟲害過程中發(fā)揮著重要作用[6]。人參皂苷作為人參的重要次生代謝成分，在抵抗病原微生物的侵害方面也有重要作用。加拿大學(xué)者Bernards對西洋參的根系分泌物進行研究發(fā)現(xiàn)，22 d內(nèi)大約有12 mg人參皂苷被釋放進土壤中，并且西洋參根際土壤中含有的人參皂苷成分對土傳病原菌具有顯著地影響作用[7-8]。另有研究表明，不同濃度的人參根系分泌物成分對人參致病菌如人參立枯絲核菌、菌核菌和銹腐菌菌落生長以及人參黑斑菌、銹腐菌孢子萌發(fā)的作用具有顯著差異[9]。這些研究都在一定程度上反映了人參皂苷對微生物的作用效果，但對其化學(xué)防御作用卻沒有明確的解釋。

白菜白斑病、番茄早疫菌病分別是白菜和番茄中常見的病害。其中白菜白斑病主要危害其葉片，病斑呈圓形或卵圓形，灰白色至淡褐色，邊緣常有黃綠色暈圈，后期病斑半透明，薄如窗紙，有時開裂，穿孔。重時病葉黃枯[10]。而番茄早疫病又稱輪紋病，病原菌為半知亞門茄鏈格孢菌Alternariasolani。此病侵染葉片、莖部和果實，嚴重時引起落葉、落果和斷枝，病害流行年份造成巨大損失[11]。

因此，本實驗旨在通過研究不同濃度的人參總皂苷對兩種常見蔬菜病原菌菌落生長速率和孢子萌發(fā)的影響，探討人參皂苷在白菜和番茄生長過程中對其病原微生物的化學(xué)防御作用。為進一步研究人參皂苷在蔬菜類作物防病治病方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人參皂苷溶液的配制

本實驗所用人參總皂苷由吉林省人參工程技術(shù)研究中心實驗室提供。

精確稱量各組人參皂苷0.1 g，用蒸餾水溶解后，用容量瓶定容至10 mL，即得到濃度為10 mg·mL-1的皂苷母液，備用。

1.2 供試菌種

受試菌種包括白菜白斑菌Cercosporellabrassicae、番茄早疫菌Alternariasolani，均由吉林省人參工程技術(shù)研究中心實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。

1.4 實驗方法

1.4.1菌落生長實驗 本實驗采用菌絲生長速率法測定病原菌菌落的生長速度。在無菌條件下，將預(yù)先配制好的人參皂苷母液經(jīng)細菌濾器過濾后，用移液槍分別精確量取0.125 mL，0.25 mL，0.50 mL，1.00 mL加入到融化好的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(100 mL)中。充分搖勻后，將培養(yǎng)基倒入經(jīng)高溫滅菌的培養(yǎng)皿(d=9 cm)中，待冷凝后備用。對照組加入等量無菌水。

將供試病原菌(白菜白斑菌、番茄早疫菌)分別在不含任何添加物的正常馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2～3代以后，選擇長勢均勻一致的區(qū)域，用直徑為9 mm的打孔器在培養(yǎng)基上打取菌餅，然后將菌餅移至添加有不同濃度人參皂苷的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板中央處，有菌絲的一面向下。每個平板接種一個菌餅，每個處理三次重復(fù)，以加入等量無菌水的培養(yǎng)基為對照。于26 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，用游標卡尺按照“三線均分法”(即用三條成60°角的直徑將培養(yǎng)皿圓周平均分割，沿每條直徑測量菌落直徑)每24 h測量一次菌落直徑，連續(xù)觀測4～5天。菌落生長抑制率計算公式[9]如下：

1.4.2 孢子萌發(fā)實驗 本實驗采用孢子懸滴萌發(fā)法測定孢子萌發(fā)率[12，9]。在無菌條件下，將培養(yǎng)好的病原菌菌種用無菌水浸泡，并用接種針刮下菌落，收集經(jīng)紗布過濾后的濾液，在顯微鏡下檢查孢子數(shù)量，以10×10低倍鏡下，每個視野30～50個孢子為宜，即制備出病原菌的孢子懸浮液。

取10 μL孢子懸浮液與稀釋好的人參皂苷溶液(濃度分別為：12.5、25、50 和100 mg·L-1)等量混合后，加入雙凹載玻片中。將載有懸浮液的凹玻片倒置于保濕培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，12 h后記錄10倍目鏡×40倍物鏡視野下100個孢子的萌發(fā)情況，以孢子芽管長超過孢子短直徑一半時即為萌發(fā)，計算孢子萌發(fā)率。每個處理3次重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果用Excel(2007版)軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 17.0中的單因素方差分析(One-wayANOVA)結(jié)合LSD法對統(tǒng)計結(jié)果進行顯著性方差分析。不同處理間不含相同英文字母表示差異顯著(P<0.05)，相同英文字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1人參皂苷對白菜白斑菌菌落生長的影響

圖1 人參總皂苷對白菜白斑菌生長的影響

由圖1可知，總體上，各處理菌絲的生長速率隨時間的延長而不斷增加，但24～48 h內(nèi)的增幅最大，此后逐漸降低。培養(yǎng)24 h后，各處理較對照均表現(xiàn)出促進作用，但只有低濃度的兩個處理(12.5、25 mg·L-1)促進效果與對照差異顯著(P<0.05)。而中高濃度(50、100 mg·L-1)處理的促進作用與對照組差異不顯著；隨著培養(yǎng)時間的增加，各處理的促進作用開始減弱，72 h時高濃度(100 mg·L-1)處理的菌落最先表現(xiàn)出抑制作用；培養(yǎng)96 h后，中高濃度(50、100 mg·L-1)的兩個處理均顯著抑制了白菜白斑菌的生長速度，抑制率分別為8.94%和9.93%。

2.2 人參皂苷對番茄早疫菌菌落生長的影響

圖2 人參總皂苷對番茄早疫菌生長的影響

由圖2所示。各處理菌絲的總體生長速率隨時間增加而增加，在培養(yǎng)初期增幅較大，72 h后變化不明顯。在菌落生長的48 h內(nèi)，12.5和25 mg·L-1兩個處理較對照組均表現(xiàn)出明顯的促進作用(P<0.05)，其中24 h時，濃度為25 mg·L-1的促進率為11.93%，略高于12.5 mg·L-1的處理(11.42%)；72 h時，100 mg·L-1的處理最先表現(xiàn)出顯著地抑制作用；隨著培養(yǎng)時間的增加，50 mg·L-1(96 h)和25 mg·L-1(120 h)依次表現(xiàn)出抑制作用；在實驗?zāi)┢?120 h)，100 mg·L-1處理的抑制率達13.98%，抑制作用最為顯著(P<0.05)。

2.3 人參皂苷對白菜白斑菌和番茄早疫菌孢子萌發(fā)的影響

由表1可知，人參總皂苷低濃度處理略有促進，但與對照差異不顯著；中高濃度(50、100 mg·L-1)處理對白菜白斑菌的孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用(P<0.05)，抑制率分別為8.59%和9.20%。而人參皂苷對番茄早疫菌孢子萌發(fā)的影響顯示，低中濃度處理能促進孢子萌發(fā)，其中25 mg·L-1促進率為10.24，中高濃度(50、100 mg·L-1)處理均對其孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用(P<0.05)，抑制率分別為6.02%和12.66%。

表1 人參總皂苷對白菜白斑菌和番茄早疫菌孢子萌發(fā)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標準差；抑制率為負表示促進，抑制率為正表示抑制

3 討論

人參皂苷是人參、西洋參的一種次生代謝產(chǎn)物，由苷元與糖相聯(lián)構(gòu)成，屬于三萜類皂苷(triterpenoid saponins)[13]。三萜皂苷是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物界中，可用作藥物，同時有抗菌和抗蟲害的作用，具有重要的商業(yè)價值[14]。多數(shù)萜類化合物都具有抑菌和殺菌的作用。植物為了有效地保護自身免受病原菌的侵害而長期進化產(chǎn)生的一系列化學(xué)防御物質(zhì)[15]。從輻射松Pinusradiata中分離的二萜化合物對松樹病原菌Dothistromapini有很高的抗菌活性，這些萜類化合物還能抑制孢子的萌發(fā)和菌絲體的生長[16]。日本花柏Chamaecyparispisifera的葉子和枝條中含有的二萜化合物對水稻病原菌Pyriculariaoryzae也呈現(xiàn)出抗菌活性[17]。Cole等[18]發(fā)現(xiàn)唇形科黃芩屬Scutellaria中的二萜化合物不僅對Fusarium oxysporum 等病原菌具有抗菌和抑制孢子萌發(fā)的生物活性，而且還顯示出對昆蟲的拒食活性。

本實驗的研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的人參總皂苷對白菜白斑菌、番茄早疫菌的影響結(jié)果大致相同，在培養(yǎng)初期(24 h)均表現(xiàn)出一定的促進效果(低濃度處理尤其明顯)，隨著培養(yǎng)時間增加，各處理按照濃度高低的順序先后表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，并且抑制效果逐漸增強。這說明，白菜白斑菌和番茄早疫菌在培養(yǎng)早期可利用某些人參皂苷成分加速菌絲生長，隨著培養(yǎng)時間增加和有益成分的消耗，某些具有抑制作用的人參皂苷開始發(fā)揮作用，阻礙病原菌的生長。

不同濃度的人參總皂苷對兩種病原菌孢子萌發(fā)的作用效果相似，總體上呈低促高抑的效果，與李勇等研究的根系分泌物對人參病原菌孢子萌發(fā)的作用效果相比，人參皂苷對這兩種蔬菜病原菌孢子萌發(fā)的影響較弱[9]。

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