王玨，金一寶，王鐵杰*，李曉帆

(1.深圳市藥品檢驗研究院 深圳藥品質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣東 深圳 518057 2.深圳大學(xué) 深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東 深圳 518060)

龍葵，茄科植物龍葵SolanumnigrumL.的干燥地上部分[1]，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活血化瘀、利水消腫、止咳祛痰的功效[2]。近期研究證實其具有較好的抗腫瘤活性[3]。目前對其抗腫瘤活性成分的研究集中在皂苷類成分[4]和甾體生物堿類成分[5]等。龍葵是一年生草本植物，一年四季都可在栽培，但是其采收期對藥材的質(zhì)量有較大影響。因此，為獲得具有最佳治療效果的藥材，需要對龍葵的采收期進行研究。中藥材采收期的研究，以中藥所含化學(xué)成分作為質(zhì)量控制依據(jù)，并與藥理學(xué)緊密結(jié)合。高效液相色譜法(HPLC)先分離后分析的特點也特別適用于中藥成分的含量測定及指紋圖譜研究。本實驗旨在對不同生長周期的龍葵中的龍葵中的主要活性成分進行分析，以便更好的控制龍葵藥材的最佳采收期，為龍葵藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

共采集到不同采收期(6月至10月)的樣品共8批。龍葵藥材由沈陽藥科大學(xué)吳維春老師鑒定為SolanumnigrumL.。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀(日本島津株式會社，SEDEX MODEL 75，二元梯度泵LC-10ATVP)，色譜柱選用Phenomendex C18(4.6×250 mm，5 μm)。色譜級甲醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，色譜級乙腈(迪馬公司)，色譜級三乙胺(Fisher Scientific)，蒸餾水，無水乙醇(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，DPBS、PMS、MTS(含Ca2+、Mg2+，德國賽默飛公司)。去氫表雄酮-β-石蒜四糖苷、澳洲茄堿、澳洲茄邊堿和去半乳糖替告皂苷由龍葵提取物中分離得到[6-7]，并經(jīng) IR、NMR、HPLC等技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)和含量，質(zhì)量分數(shù)均大于 99.0%。

2 方法

2.1 細胞毒活性篩選

2.1.1 試劑的配制 PMS，將PMS溶解于DPBS中，配制成0.92 g·mL-1，過濾除菌。MTS，取250 g溶于125 mL的DPBS，混勻15 min，過濾除菌。

龍葵溶液，干燥的龍葵粉碎后過2號篩，再真空干燥12 h，取藥材粉末加60%乙醇超聲提取，微孔濾膜(0.22 μm)過濾，取續(xù)濾液使用，最終給藥濃度為100 μg·mL-1。

2.1.2 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株HepG2培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(v/v)中，置5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)約為1×104，待貼壁后，每孔加入藥物作用于細胞48 h，設(shè)6個復(fù)孔。采用MTS法，利用[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carbosym-ethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium，innersalt]形成的水溶性甲臢產(chǎn)物。吸出所有培養(yǎng)液，加入50 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL MTS-PMS(20∶1，臨用現(xiàn)配)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于490 nm波長處讀取數(shù)據(jù)，扣除背景值后。

比較按2.11所制備的不同采收期的龍葵溶液對HepG2細胞的抑制率。同時對從龍葵中分離得到的化合物去氫表雄酮-β-石蒜四糖苷(allopregnenolone β-lycotetraoside)、澳洲茄堿(solasonine)、澳洲茄邊堿(solamarging)，去半乳糖替告皂苷，測定單體化合物對HepG2細胞抑制率，用Logit法以藥理學(xué)統(tǒng)計軟件計算半數(shù)抑制濃度IC50值。

2.2 活性成分含量分析

2.2.1 色譜條件 Phenomendex C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流速1.0 mL·min-1，流動相A 相為乙腈(含0.03%三乙胺)，B 相為水/甲醇=8∶2(含0.03%三乙胺)，二元線性梯度洗脫(洗脫程序：0～10 min，A相10%至15%；10～15 min，A相15%至30%；15～30 min，A相30%至34%；30～52 min，A相34%至50%；52～55 min，A相50%至55%)，柱溫25 ℃，蒸發(fā)光檢測器蒸發(fā)管溫度設(shè)置40 ℃，進樣量20 μL[8]。

2.2.2 龍葵溶液的制備 干燥的龍葵藥材，粉碎后過2號篩，再真空干燥12 h，取藥材粉末，每份2.0 g，精密稱定。加60%乙醇20 mL，超聲提取2次，每次20 min。過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至近干，用60%乙醇轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加60%乙醇定容，搖勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液 取減壓干燥至恒重的從龍葵中提取分離的去半乳糖替告皂苷對照品適量，去半乳糖替告皂苷對照品由前期實驗室內(nèi)分離制得，經(jīng)HPLC-ELSD測定，通過峰面積計算其純度為99.2%。精密稱定去半乳糖替告皂苷對照品，加甲醇定溶至50 mL容量瓶中，制成1.001 mg·mL-1的去半乳糖替告皂甙溶液。

2.2.4 方法學(xué)驗證 標準曲線，精密吸取2.2項下的對照品溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL至10 mL量瓶中，以起始流動相溶液定容至10 mL，進樣體積20 μL，測定峰面積Y。以對照品濃度X為橫坐標，計算回歸方程。精密度試驗，取50.05 μg·mL-1的對照品溶液，重復(fù)進樣6次，在上述色譜條件測定峰面積計算RSD值。重現(xiàn)性試驗，取8月19日采集的同一批樣品，精密稱取6份，按2.2.2項下操作，在上述色譜條件測定去半乳糖替告皂苷的含量，計算RSD值。穩(wěn)定性試驗，精密吸取同一供試品試液，在室溫下放置，分別于0、2、4、8、24、48 h時測定去半乳糖替告皂苷的含量計算RSD值?；厥章试囼灒芊Q取6份8月19日的龍葵藥材，分別加入50.05 μg·mL-1濃度的對照品溶液混合，按2.2.2項下操作，測定去半乳糖替告皂苷的回收率。

2.2.5 樣品測定 按2.2.2制備不同采收期龍葵藥材供試品溶液，每個采收期各制備3份。分別取供試品溶液和對照品溶液，在上述色譜條件下測定，以外標法計算不同采收期龍葵藥材中去半乳糖替告皂苷的量。

2.2.6 指紋圖譜相似度評價 通過提取各色譜圖，導(dǎo)入至“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版本)”，進行相似度計算。

3 結(jié)果

3.1 細胞毒活性測試

3.1.1 不同采收期龍葵藥材活性評價 對6～10月期間不同采收期的龍葵藥材進行細胞毒活性測試，發(fā)現(xiàn)植物生長周期的不同對龍葵的細胞毒活性有較大的影響，且隨著生長周期的變化，細胞毒活性呈現(xiàn)出一定的趨勢性，即從7月開始出現(xiàn)明顯增強的細胞毒活性，活性水平維持一定水平直到9月初，結(jié)果見圖1。

圖1 不同采收期的龍葵藥材對HepG2細胞的抑制率

3.1.3 龍葵抗癌活性成分 比較龍葵中活性化合物去氫表雄酮-β-石蒜四糖苷(allopregnenolone β-lycotetraoside)、澳洲茄堿(solasonine)、澳洲茄邊堿(solamarging)和去半乳糖替告皂苷(degalactotionin)的IC50值，結(jié)果見表1，去半乳糖替告皂苷的IC50值最小(IC50=0.245±0.59 μmol·L-1)，即對龍葵的細胞毒活性影響最顯著。

表1 活性化合物的IC50值

3.2 不同采收期活性成分量值差異

3.2.1 測定成分的選擇 龍葵全草乙醇提取物具有較好的活性，其中化合物1、2、3、4為藥材中含有的細胞毒活性成分[3]，其中化合物4(去半乳糖替告皂苷)的活性最強。因此選擇其進行含量測定，作為控制該藥材質(zhì)量的定量指標。

3.2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 吸取去半乳糖替告皂甙對照品溶液和龍葵藥材供試品溶液，分別注入液相色譜儀，繪制色譜圖，此條件下各對照品及其它組分達到良好分離，分離度R值大于1.5，理論板數(shù)按去半乳糖替告皂甙計算不低于6000，進行含量測定。

3.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液 0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL至10 mL量瓶中，以起始流動相溶液定容至10 mL，分別取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以去半乳糖替告皂甙的峰面積積分值為縱坐標(Y)、進樣溶度μg·mL-1為橫坐標(X)，繪制標準曲線，去半乳糖替告皂甙回歸方程為 Y=1.252X+12.68，r=0.999 6。結(jié)果表明，去半乳糖替告皂甙在 10.01～200.2 μg·mL-1呈良好線性。

3.2.4 精密度試驗 取對照品溶液，重復(fù)進樣6次，計算去半乳糖替告皂甙的RSD，結(jié)果見表2，RSD為1.44%，符合精密度要求。

3.2.5 重復(fù)性試驗 稱取沈陽產(chǎn)龍葵藥材(8月19日采摘)6份，制備供試品溶液，計算化合物去半乳糖替告皂甙的RSD為2.42%(見表2)，表明方法重復(fù)性較好。

3.2.6 穩(wěn)定性試驗 室溫下分別放置0、1、4、8、12、24 h后，計算其中去半乳糖替告皂苷面積的RSD為1.95%(見表2)，表明穩(wěn)定性較好。

3.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已測8月19日樣品6份，每個樣品分別精密加入另配制的去半乳糖替告皂苷對照品溶液5.0 mL，按樣品測定項下操作，依法測定，計算回收率為98.8%(見表2)，表明方法回收率較好。

表2 去半乳糖替告皂苷測定的方法學(xué)驗證

3.3 不同采收季節(jié)對藥材的影響

3.3.1 指紋圖譜相似度比較 為了考察不同的采收季節(jié)對龍葵藥材次生代謝的影響，收集不同時期的8批龍葵藥材，分別掃描HPLC指紋圖譜，見圖3。

圖3 不同采收期龍葵藥材色譜圖(箭頭所指為去半乳糖替告皂苷)

將以上不同采收期的8批藥材，通過提取各色譜圖，導(dǎo)入至“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版本)”，進行相似度計算(見表3)，并建立指紋圖譜進行比較。經(jīng)過相似度軟件處理可以看出不同采收期的龍葵藥材之間化學(xué)成分存在較大的差異，即從7月下旬至9月，龍葵藥材的相似度較好，在90%以上，而采收時間較早或較晚的相似度較差(見表3)。

3.3.2 去半乳糖替告皂苷含量比較 活性化合物去半乳糖替告皂苷的IC50值最小，即對龍葵的細胞毒活性影響最顯著。通過測定不同采收期的龍葵藥材化合物去半乳糖替告皂苷含量的結(jié)果見表3。從7月開始，龍葵藥材內(nèi)的去半乳糖替告皂苷含量開始升高，在7月下旬達到峰值后，緩慢下降。

表3 不同采收期龍葵的指紋圖譜相似度和去半乳糖替告皂苷含量

4 討論

Oween[9]等設(shè)計的MTT類似物——MTS，與MTT法相比，操作簡便，易于配制和儲存，相比MTT法敏感性高、特異性強、重復(fù)性好[10]。經(jīng)過對不同采收期的龍葵藥材的細胞毒活性測試，發(fā)現(xiàn)植物生長周期的不同對龍葵的細胞毒活性有較大的影響，并且隨著生長周期的變化，細胞毒活性呈現(xiàn)出一定的趨勢性。為了闡明其中的細胞毒活性成分，對龍葵藥材的化學(xué)成分進行研究，確定去半乳糖替告皂苷的細胞毒活性最強，為后續(xù)含量測定奠定基礎(chǔ)利用HPLC技術(shù)對龍葵藥材進行分析，方法學(xué)考察證明本方法的各項指標良好。通過指紋圖譜的相似性可明顯看出不同采收期的龍葵藥材具有顯著差異。同時利用HPLC對龍葵的中的主要細胞毒活性化合物去半乳糖替告皂苷進行含量分析，發(fā)現(xiàn)去半乳糖替告皂苷的含量隨生長時間而發(fā)生變化，因此，推測龍葵藥材的細胞毒活性隨采收期的時間變化的原因就是其藥效成分量值變化所導(dǎo)致的。

為了比較不同采收期對藥材的影響，將不同采收期藥材相似度，活性化合物去半乳糖替告皂苷的含量與抑制率擬合成的相關(guān)趨勢線如圖4。如圖所示，龍葵藥材隨采收日期的變化其相似度值呈規(guī)律性變化。這種規(guī)律性的變化揭示了藥材的生長周期。從圖4可以看出，在6月下旬至7月上旬采集的藥材相似度很低，相似度值在0.5以下，7月中旬至8月初采集的藥材相似度攀升，8月5日采集的藥材相似度達到0.994。從8月初至9月中旬，均有較高的相似度，相似度位于0.95以上。到了9月末相似度呈下降的趨勢，10月5日采集的藥材相似度為0.814，已經(jīng)低于0.85。根據(jù)藥材相似度結(jié)合不同采收期藥材的活性變化趨勢線，基本上可以確定藥材的采收期為7月上旬至9月初。然而通過觀察活性化合物去半乳糖替告皂苷的含量變化，發(fā)現(xiàn)去半乳糖替告皂苷的含量高低對藥材活性也有較大的影響，但是隨著進入8月后，龍葵藥材中的去半乳糖替告皂苷的含量開始逐漸減少，但其藥效作用依然保持至9月初，說明在龍葵藥材中其它皂苷類、茄堿類成分雖然不具備最強的細胞毒性，但可能由于后續(xù)的含量累計維持了龍葵的抗癌活性。

圖4 不同采收期龍葵藥材的相關(guān)趨勢比較

通過細胞毒活性測試，指紋圖譜相似度評價和最強活性成分的含量測定三個方面相結(jié)合對固定產(chǎn)地不同采收期的龍葵藥材進行研究，發(fā)現(xiàn)了不同采收期對藥材的品質(zhì)具有影響，為今后龍葵的研究與開發(fā)提供實驗依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄23.

[2] 李志輝，孟軍華，肖暉.龍葵的質(zhì)量分析研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，23(6)：661-664.

[3] 羅文娟，王光輝，周新蘭，等.螺甾皂苷類化合物的體外抗人肝癌細胞增殖作用[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15(3)：307-308.

[4] Loganayaki N，Siddhuraju P，Manian S.Antioxidant Activity of Two Traditional Indian Vegetables：SolanumnigrumL.andSolanumtorvumL[J].Food Sci.Biotechnol，2010，19(1)：121-127.

[5] Wang H C，Chung P J，Wu C H，et al.SolanumnigrumL.polyphenolic extract inhibits hepatocarcinoma cell growth by inducing G2/M phase arrest and apoptosis[J].J Sci Food Agric，2011，91(1)：178-185.

[6] 王立業(yè)，王乃利，姚新生.龍葵中的非皂苷類成分[J].中藥材，2007，30(7)：792-794.

[7] 周新蘭，何祥久，周光雄，等.龍葵全草皂苷類化學(xué)成分研究[J].中草藥，2006，37(11)：1618-1621.

[8] 王玨，金一寶，王鐵杰，等.不同產(chǎn)地龍葵藥材的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測指紋圖譜[J].色譜，2015，33(8)：809-815.

[9] Brttke T M，McCubrey J A，Owen T C.Use of aqueous soluble tetrazolium/formazan assay to measure viability and prolifeation of lymphokine-dependent cell lines[J].J Immunol Methods，1993；15(7)：233-240.

[10] 葉萍，李燕，谷淑燕.MTS和MTT法檢測小鼠NK及特異性細胞毒性T細胞活性的比較[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，1998，12(1)：85-86.