張娟，馮春艷，卿德剛，孫宇，倪慧*，賈曉光

(1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；2.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

甘草渣為甘草提取浸膏后的藥渣，富含黃酮類物質(zhì)，具有抗真菌、抗?jié)儭⒖寡趸?、保肝及降血糖等多種生物活性[1-3]，可作為藥品、保健食品、化妝品的原料使用。目前已有相關(guān)專利和文獻(xiàn)報(bào)道了甘草渣或甘草渣總黃酮作為活性提取物應(yīng)用的實(shí)例，但都未明確其主要指標(biāo)性成分[4-6]。新疆是我國(guó)最大的甘草產(chǎn)地及甘草初加工產(chǎn)品產(chǎn)地，生產(chǎn)中產(chǎn)生大量甘草渣。為了更好地利用甘草渣資源，我們?cè)诿浌什菰瘜W(xué)成分較為系統(tǒng)的分離鑒定基礎(chǔ)上[7-11]，以HPLC分析脹果甘草渣及其黃酮制品中的主要化學(xué)成分，同時(shí)檢測(cè)其中甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的含量，以期為脹果甘草渣的開發(fā)利用及其黃酮制品質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2998PDA檢測(cè)器；JY92-2D超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Metter AE163電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 材料

乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，水(超純水)，其他試劑均為分析純。

α，2′，4，4′-四羥基查爾酮、刺甘草查爾酮、芒柄花素、甘草黃酮、甘草黃酮C、甘草查爾酮C、甘草查爾酮A、甘草查爾酮D、甘草黃酮B、kanzonol E(自制，經(jīng)UV、IR、NMR和MS鑒定結(jié)構(gòu)，含量>98%)；對(duì)照品甘草苷(批號(hào)：111610-201106)、甘草次酸(批號(hào)：1063-050327)、甘草酸銨(批號(hào)：110731-201317)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

脹果甘草渣(新疆阿拉爾新農(nóng)甘草產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：2014061 1)是經(jīng)水提取甘草酸殘留的渣，參考自有專利技術(shù)[12]以3批脹果甘草渣分別制備獲得3批脹果甘草渣黃酮制品。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脫(0～34 min，15%→47%A，85%→53%B；34～36 min，47%A，53%B；36～60min，47%→60%A，53%→40%B)，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm(化學(xué)成分分析)、310 nm(甘草查爾酮A、甘草黃酮B)、254 nm(甘草次酸)，柱溫：30 ℃，洗脫流速：1.0 mL·min-1。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取甘草渣2.0 g，精密加甲醇30 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲(200 W、50 Hz)1 h，冷卻，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

精密稱取甘草渣黃酮制品25 mg，甲醇超聲(200 W、50 Hz)溶解并定容至25 mL，過濾，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取α，2′，4，4′-四羥基查爾酮、刺甘草查爾酮、芒柄花素、甘草黃酮、甘草黃酮C、甘草查爾酮C、甘草查爾酮A、甘草查爾酮D、甘草黃酮B、kanzonol E、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸適量，分別加甲醇溶解并定容至5 mL，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取質(zhì)量濃度分別為0.055 27、0.110 54、0.138 17、0.165 81、0.221 08 mg·mL-1的甘草查爾酮A，質(zhì)量濃度分別為0.018 91、0.037 82、0.075 64、0.113 46、0.151 28 mg·mL-1的甘草黃酮B，質(zhì)量濃度分別為0.012 31、0.024 62、0.036 93、0.049 24、0.061 55 mg·mL-1的甘草次酸對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果

3.1 主要化學(xué)成分的分析

在上述色譜條件下，進(jìn)行了波長(zhǎng)選擇，結(jié)果280 nm下能夠更為全面地反映脹果甘草渣及其黃酮制品中的各個(gè)成分。通過與各對(duì)照品的比對(duì)，初步確認(rèn)脹果甘草渣及其黃酮制品中含有α，2′，4，4′-四羥基查爾酮、刺甘草查爾酮、芒柄花素、甘草黃酮、甘草黃酮C、甘草查爾酮C、甘草查爾酮A、甘草查爾酮D、甘草黃酮B、kanzonol E 10種黃酮成分(見圖1)，其中甘草查爾酮A的響應(yīng)最高。

注：1.α，2′，4，4′-四羥基查爾酮；2.刺甘草查爾酮；3.芒柄花素；4.甘草黃酮；5.甘草黃酮C；6.甘草查爾酮C；7.甘草查爾酮A；8.甘草查爾酮D；9.甘草黃酮B；10.kanzonol E。圖1 脹果甘草渣化學(xué)成分分析色譜圖(280 nm)

在254 nm下發(fā)現(xiàn)脹果甘草渣中還含有三萜成分——甘草次酸。但是在3個(gè)波長(zhǎng)下，《中華人民共和國(guó)藥典》[13]“甘草”項(xiàng)記載的甘草苷、甘草酸銨的響應(yīng)都很低(見圖2)。本文選擇含量最高的甘草查爾酮A和分離度較好的甘草黃酮B、甘草次酸進(jìn)行含量測(cè)定。

注：1.甘草苷；2.甘草酸銨；3.甘草次酸。圖2 脹果甘草渣中甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸色譜圖(254 nm)

3.2 含量檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證及結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表1，甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸分別在0.552 7～2.210 9、0.189 1～1.513 1、0.123 1～0.615 4 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的回歸方程及線性范圍

3.2.2 精密度試驗(yàn) 取同批脹果甘草渣(批號(hào)：20140611)，按2.2方法制備供試品溶液，連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果表明3種成分含量測(cè)定結(jié)果的RSD分別為2.33%、1.11%、1.70%。表明儀器在該色譜條件下的精密度良好。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批脹果甘草渣(批號(hào)：20140611)，按2.2方法平行制備6份供試品溶液，分別測(cè)定，考察重復(fù)性。結(jié)果3種成分含量測(cè)定結(jié)果的RSD分別為2.34%、2.06%、3.19%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同批甘草渣(批號(hào)：20140611)，按2.2方法制備供試品溶液，室溫密閉放置0、3、6、9、15、24 h分別測(cè)定，考察穩(wěn)定性。結(jié)果3種成分含量測(cè)定結(jié)果的RSD分別為2.18%、1.99%、3.01%，表明這3種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸含量的脹果甘草渣樣品6份，分別加入2.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 mL，按2.2方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算各組分加樣回收率。結(jié)果甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的平均回收率分別為101.4%、98.4%、103.1%，RSD分別為2.11%、1.29%、2.31%。

3.2.6 樣品測(cè)定 分別檢測(cè)3批甘草渣及以其為原料制備得到的黃酮制品[12]中甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸含量，考察工藝富集效果，結(jié)果見表2、圖3。

表2 脹果甘草渣及其黃酮制品中3種成分的含量測(cè)定結(jié)果(n=3) %

注：1.甘草查爾酮A；2.甘草黃酮B。圖3 甘草渣及甘草渣黃酮制品中甘草查爾酮A、甘草黃酮B色譜圖(310 nm)

注：1.甘草次酸。圖4 甘草渣及甘草渣黃酮制品中甘草次酸色譜圖(254 nm)

4 結(jié)論

本文參考課題組甘草渣黃酮成分分離鑒定研究結(jié)果[7-11]，完成了脹果甘草渣及其黃酮制品中10種黃酮成分和1種三萜成分的鑒定。甘草由水煮提甘草酸或甘草浸膏的過程中，甘草苷幾乎完全被提取，甘草渣中甘草酸的響應(yīng)相比甘草也大大降低，即甘草中2種主要成分在渣中殘留已經(jīng)很少。同時(shí)，我們也確認(rèn)了脹果甘草渣及其黃酮制品是由甘草查爾酮A為主的查爾酮類成分構(gòu)成，并含有另一種三萜成分——甘草次酸，這種化學(xué)成分組成上的較大變化也為甘草渣開發(fā)利用提供了新的可能性，課題組用本文所述黃酮制品研究了其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的防治效果，結(jié)果其效果優(yōu)于甘草苷為主要成分的水溶性黃酮，灌胃量為400 mg·kg-1時(shí)還優(yōu)于陽(yáng)性藥柳氮磺胺吡啶[14]，具有較大的深入開發(fā)價(jià)值。

對(duì)比3批脹果甘草渣及其對(duì)應(yīng)黃酮制品中3種成分的含量，相比原甘草渣甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的含量分別提高了25倍、46倍、32倍以上，可見工藝達(dá)到了較好的富集目的[12]。但是，3種成分的含量因甘草渣原料波動(dòng)而波動(dòng)，這也意味著建立甘草渣及其黃酮制品質(zhì)量控制方法的必要性。

本文建立了同時(shí)檢測(cè)脹果甘草渣及其黃酮制品中甘草查爾酮A、甘草黃酮B、甘草次酸的含量測(cè)定方法，方法學(xué)研究表明其準(zhǔn)確可靠、可行性及重復(fù)性良好，可作為質(zhì)量控制的定量方法。

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