任喬森，王海洋，翟宏宇，趙琳琳，李秀芬，唐秋竹

(吉林省藥品檢驗所，吉林 長春 130033)

朝鮮白頭翁為毛茛科植物Pulsatillacernua(Thanb.)Bercht et Opiz.的干燥根[1]，分布于中國遼寧南部、吉林東部，在朝鮮、日本、俄羅斯遠東地區(qū)也有分布，生于山坡草地、灌叢間。其性寒，味苦，歸肝、胃經(jīng)。具瀉火解毒、止痛、利尿消腫、涼血等功效[2]。朝鮮白頭翁是朝鮮族民間用藥，其用藥歷史可追溯到14世紀，主治風火牙痛、四肢關(guān)節(jié)疼痛、禿瘡、浮腫、細菌性痢疾、阿米巴痢疾、發(fā)熱、腹痛、下痢膿血、里急后重等證；現(xiàn)代藥理研究表明，朝鮮白頭翁還具有抑菌抗炎、抗微生物、抗生物酶、抗腫瘤等作用[3-6]。據(jù)文獻報道，朝鮮白頭翁中含有豐富的皂苷類成分，三萜皂苷是其主要的活性物質(zhì)，現(xiàn)文獻報道多集中在白頭翁屬植物中總皂苷的含量測定[7-9]，而對某一單一成分的含量測定報道較少。本文采用HPLC對不同產(chǎn)地朝鮮白頭翁中專屬性成分——常春藤皂苷C進行含量測定，并分析其分布特點，為朝鮮白頭翁的臨床療效和質(zhì)量控制提供一定的實驗參考。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent)；BT-125D型分析天平(德國Sartorius)；DK-98ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；6202高速粉碎機(北京銀捷玉誠機械設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與材料

常春藤皂苷C對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：Must-16032507，純度：98.53%)；甲醇、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；其他試劑均為分析純，水為超純水。

實驗中所用的18批朝鮮白頭翁藥材均由樸明杰采集自吉林省各地，由吉林省藥品檢驗所溫立義副主任中藥師鑒定為朝鮮白頭翁Pulsatillacernua(Thanb.)Bercht et Opiz.的干燥根，烘干，備用。朝鮮白頭翁藥材樣本的采集信息見表1。

表1 采集的朝鮮白頭翁藥材信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent 1200高效液相色譜儀；Thermo Hypersil BDS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(28∶72)；流速：0.8 mL·min-1，柱溫：35 ℃，檢測波長：201 nm。

2.2 對照品溶液的制備

取常春藤皂苷C對照品適量，加50%乙醇水制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取適量朝鮮白頭翁藥材，粉碎，過3號篩，精密稱定，稱取1 g于具塞錐形瓶中，向其加入50%乙醇水溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%乙醇水補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置25 mL量瓶中，加50%乙醇水定容至刻度，即得供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 空白對照試驗 取50%乙醇水作為空白對照溶液，按2.1項下色譜條件進行測定分析，結(jié)果顯示，空白對照溶液在與常春藤皂苷C對照品色譜峰保留時間處無色譜峰，表明溶劑對測定沒有干擾(見圖1、2)。

圖1 溶劑(50%乙醇)色譜圖

圖2 常春藤皂苷C對照品色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液2、4、8、12、16、20 μL注入色譜儀，按2.1項下色譜條件進行測定，以常春藤皂苷C的含量(μg)和相應的峰面積進行線性回歸，計算得回歸方程Y=364.534 1X-1.326 2，r=0.999 9，結(jié)果表明常春藤皂苷C在0.220～2.203 μg線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液(S4)，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，供試品色譜峰峰面積的RSD=0.48%，表明儀器的精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取2.3項下的供試品溶液(S4)，按2.1項下色譜條件分別于0、6、8、12、18、24 h進樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示常春藤皂苷C色譜峰峰面積的RSD=0.11%，表明供試品溶液中常春藤皂苷C在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取2.3項下的供試品溶液(S4)6份，分別照2.1項下方法測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示常春藤皂苷C峰面積的RSD=1.44%，表明此方法的重復性良好。

2.4.6 回收率試驗 分別精密稱取樣品(S4)1 g，共6份，分別加入常春藤皂苷C對照品適量，按2.2項下方法制備，按2.1項下色譜條件進行測定，計算常春藤皂苷C的回收率。結(jié)果見表2。

表2 朝鮮白頭翁中常春藤皂苷C回收率試驗結(jié)果(n=6)

注：常春藤皂苷C對照品加入量均為19.036 0 mg。

2.4.7 耐用性試驗 實驗中選取了不同廠家色譜柱(Thermo Hypersil BDS C18、Phenomenex Gemini C18、Venusil XDP C18)及不同廠家和型號的高效液相色譜儀(Agilent 1290、島津LC-20A、Waters E2695)測定各供試品，結(jié)果顯示不同廠家色譜柱和不同儀器均能對樣品進行較好分離，適用性良好。

2.5 樣品測定

分別取不同產(chǎn)地的18批朝鮮白頭翁藥材，按2.3項下的方法制備供試品溶液，照2.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算含量，結(jié)果見表3、圖3。

表3 朝鮮白頭翁樣品中常春藤皂苷C含量測定結(jié)果(n=3)

圖3 朝鮮白頭翁供試品色譜圖

由表3可以看出，18批朝鮮白頭翁中常春藤皂苷C含量測定結(jié)果為0.806%～4.317%，差異較大，其中，采集于延吉市依蘭鎮(zhèn)臺巖村的朝鮮白頭翁(S3)中常春藤皂苷C含量最高，為4.317%；而采集于通化縣東來鄉(xiāng)的樣品(S15)中常春藤皂苷C含量最低，僅為0.806%。

3 討論

3.1 提取時間的考察

實驗在前期研究的基礎(chǔ)上對提取時間進行考察，分別選取30、60、120 min進行回流提取，結(jié)果顯示，提取30 min和提取120 min所得色譜峰的峰面積均低于提取60 min的峰面積，因此實驗選取提取60 min為最佳提取時間。

3.2 流動相的選擇

《中華人民共和國藥典》白頭翁含量測定項下提取三萜皂苷類成分的溶劑和流動相均采用了甲醇[10]，而甲醇在201 nm有末端吸收，必然會對特征圖譜的色譜行為有干擾。經(jīng)試驗，將白頭翁含量測定項選用的“甲醇-水”更改為“乙腈-水”，得到的色譜峰信息最多，且各成分分離情況相對較好，故最終選定乙腈-水系統(tǒng)作為流動相。

3.3 常春藤皂苷C的含量差異

18批朝鮮白頭翁樣品中常春藤皂苷C的質(zhì)量分數(shù)在0.806%～4.317%，結(jié)果顯示，采集于延邊地區(qū)的含量要明顯高于其他地區(qū)，而采集于通化市、白山市、集安市等地的常春藤皂苷C含量較低，提示延吉地區(qū)為用藥的優(yōu)選區(qū)域。但朝鮮白頭翁系多年生草本植物，影響含量的因素較多，除生長地域外，生長環(huán)境、生長年限、采收時間以及藥材的凈制程度等也都是影響含量高低的因素。

3.4小結(jié)

本文采用HPLC研究了朝鮮白頭翁中常春藤皂苷的含量，方法學考察結(jié)果顯示，本方法專屬性和重現(xiàn)性強、回收率好，可用于評價朝鮮白頭翁的質(zhì)量。

常春藤皂苷C為朝鮮白頭翁中三萜皂苷的主要類型，含量較高，已證實其具有抑菌抗炎、清熱解毒等生物活性，可作為朝鮮白頭翁含量測定的主要指標及質(zhì)量控制依據(jù)。

[1] Flora of China Editorial Committee. Flora of China：Volume 6[M]. Beijing： Science Press & Missouri Botanical Garden，2001：329-333.

[2] 徐志遠，郭彩云.長白山植物藥志[M].長春：吉林人民出版社，1982：399.

[3] 張秋華，王丹，王維寧，等.不同品種白頭翁抑菌、抗炎、抗腹瀉作用和對兔離體十二指腸運動的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2011，18(6)：496-498.

[4] Lee H S.Tyrosinase inhibitors ofPulsatillacernuaroot-derived materials [J].Agric Food Chem，2002，50(6)：1400-1403.

[5] Kim J M，Kim K S，Lee Y W，et al.Anti-angiogenic effects of water extract of a formula consisting ofPulsatillakoreana,PanaxginsengandGlycyrrhizauralensis[J].中西醫(yī)結(jié)合學報，2011，9(9)：1005-1013.

[6] 李勇，林翠英.白頭翁屬植物化學成分及活性研究概述[J].天津中醫(yī)藥，2005，22(6)：526.

[7] 郝寧，李海燕，李宏博，等.白頭翁及其同屬植物總皂苷含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23(10)：2474-2475.

[8] 俞冰薈，饒毅，楊世林，等.白頭翁提取物中總皂苷及皂苷類成分的測定[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20(15)：65-68.

[9] 劉建宇，馬靜，宮益霞，等.朝鮮白頭翁皂苷類化學成分研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2015，17(2)：45-48.

[10] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：104.