郭佳琪，楊印軍，方偉，郭寶林

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

《中華人民共和國藥典》2015年版一部規(guī)定柴胡藥材來源于北柴胡BupleurumchineseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的根。然而，20世紀(jì)80年代以前柴胡來源于野生，后因資源不足，各地進(jìn)行了引種和栽培，目前栽培藥材已經(jīng)成為主流。作者在2013年和2015年兩次對甘肅、山西、陜西、河北等柴胡種植主產(chǎn)地進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)早期引種于當(dāng)?shù)匾吧髁魑锓N，但由于植物、藥材和種子較難鑒別，以及種子價格和種植產(chǎn)量不同，以柴胡皂苷含量為主導(dǎo)的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)等多因素影響，柴胡藥材的資源構(gòu)成隨時間而變化，現(xiàn)在市場的栽培柴胡主流藥材是3個，分別為北柴胡、竹葉柴胡(又稱膜緣柴胡)B.marginatumWall.ex DC.和藏柴胡(為市場俗稱，植物來源為窄竹葉柴胡B.marginatumWall.ex DC.var.stenophyllum(Wolff)Shan et Y.Li)。藏柴胡最早引種自西藏，因產(chǎn)量高和柴胡皂苷含量高，在甘肅渭源、臨洮、康樂等地大量種植，并逐漸輻射到山西、青海等省區(qū)(藥材形態(tài)以根較長，柔軟，斷面韌皮部比例高為特點(diǎn))，市場上還有來源于西藏和青海的野生資源，本研究組曾針對藏柴胡進(jìn)行過系統(tǒng)的化學(xué)研究[1-2]；竹葉柴胡在甘肅廣為栽培(也有人認(rèn)為是銀州柴胡B.yinchowenseShan et Y.Li[3]，藥材形態(tài)以根少分枝，木質(zhì)部寬而柴性強(qiáng)，莖殘基密集葉鞘痕為特點(diǎn))，且因為種子產(chǎn)量高、播種后萌發(fā)率高等優(yōu)勢，被山西、陜西、河北等原北柴胡主產(chǎn)區(qū)引入種植，市場占比在不斷升高。本文收集了當(dāng)前3種藥材主產(chǎn)地的樣品，研究其中總皂苷和柴胡皂苷a、d的含量，以進(jìn)行比較。

1 材料

1.1 實驗樣品

藥材來源信息見表4，均于2016年上半年收集，為2015年產(chǎn)藥材，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員對藥材性狀進(jìn)行鑒別。共33批，其中藏柴胡16份，包括種植和野生來源，種植北柴胡10份，種植竹葉柴胡7份，均去掉殘留地上莖，粉粹，過四號篩。

1.2 儀器及試劑

GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，BP 211D十萬分之一天平(德國Satorius公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，Waters 2695高效液相色譜儀(Empower工作站)配置Waters 2478 DAD檢測器，EYELAOSB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，unico UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計。

柴胡皂苷a(批號16060105)、柴胡皂苷d(批號16060106)對照品均購于成都曼斯特生物技術(shù)有限公司，面積歸一化法測定純度均>98%。Fisher乙腈(色譜純)，蒸餾水購于廣州屈臣氏有限公司，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷含量測定[4]

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a 12.68 mg的標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，配成2.536 mg·mL-1備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取柴胡樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨-甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃水溫超聲處理30 min(100 W)，濾過，用甲醇20 mL分兩次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 最佳測定波長選擇 取對照品溶液200 μL，在樣品中加入濃度1%的對二甲氨基苯甲醛的乙醇溶液，在70 ℃的水浴中反應(yīng)10 min，放置室溫，再加入磷酸4 mL，并在70 ℃的水浴中反應(yīng)30 min，放置室溫后，以空白溶媒作為空白校正，進(jìn)行掃描(400～600 nm)。結(jié)果在547 nm左右有最大吸收峰，故確定檢測波長為547 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取對照品母液10 μL、25 μL、50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、1000 μL定容至2 mL容量瓶中，按“2.1.3”方法處理，于547 nm的波長下測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以柴胡皂苷a的濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度值(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=1.155 8x-0.032 8，r=0.999 8。結(jié)果顯示，柴胡皂苷a在0.063 4～2.536 mg·mL-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 取同一份柴胡皂苷供試品溶液(SX-BC-07)，按“2.1.3”項下方法測定吸光度，重復(fù)測定6次，RSD為0.10%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同一份柴胡樣品(SX-BC-07)粉末0.5 g，平行6份。按照“2.1.2”項下制備供試品溶液并按“2.1.3”項下方法操作方法測定吸光度，計算得R為2.79%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取柴胡(SX-BC-07)供試品溶液，按照“2.1.3”項下方法于配制后0、1、2、3、4、5 h測定吸光度，計算得RSD為0.88%，結(jié)果表明供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收試驗 取柴胡(SX-BC-07)粉末0.25 g，精密稱定。加入對照品柴胡皂苷a適量，按照“2.1.2”項下方法制備溶液并按照“2.1.3”項下測定，測得平均加樣回收率為102.24%，RSD為2.24%，表明總皂苷回收率良好。結(jié)果見表1。

2.1.9樣品的含量測定 分別取33個樣品粉末0.5 g，按照“2.1.2”項下方法制備溶液并按照“2.1.3”項下測定，測定結(jié)果見表4。

表1 柴胡總皂苷加樣回收實驗

注：加入成分為柴胡皂苷a

2.2 柴胡皂苷a、d的含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 取柴胡皂苷a、d的對照品(精密稱定)，加入5%濃氨-甲醇溶液制成每1 mL含柴胡皂苷a 4.8 mg，柴胡皂苷d 5.4 mg的溶液，搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品母液。

2.2.2 供試品溶液制備 按照“2.1.2”項下制備方法，蒸干溶劑后，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 采用Agela ODS-2色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)、乙腈-水(A-B)為流動相；梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為210 nm。柱溫為室溫，進(jìn)樣10 μL。梯度洗脫條件：0～23 min，75%～45%A；23～25 min，45%～75%A；25～35 min，75%A。色譜圖如圖1所示：

圖1 混合對照品和柴胡樣品(SX-BC-03)的HPLC圖

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系 將對照品母液對半稀釋得各系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照“2.2.3”項下條件進(jìn)樣10 μL測定，以峰面積(Y)和對照品濃度(X，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得各對照品回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。以信噪比S/N=3為基準(zhǔn)，測得最低檢測限，以信噪比S/N=10為基準(zhǔn)，測得最小定量限，結(jié)果見表2。

表2 柴胡皂苷a、d的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限

2.2.4.2 精密度試驗 精密吸取0.30 mg·mL-1、0.60 mg·mL-1、1.20 mg·mL-1的3種濃度的對照品溶液按“2.2.3”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，對照品柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的峰面積 RSD分別為1.24%、0.64%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗 取樣品粉末(ZC-09)6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜方法測定，計算樣品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積的RSD分別為0.85%、0.49%，結(jié)果表明實驗重復(fù)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取一份供試品溶液(BC-03)，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測定。計算柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積的RSD值分別為1.01%、2.42%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.5 加樣回收試驗 取已知含量的供試品粉末(SX-BC-03)6份，每份各約 0.25 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞三角瓶中，分別精密加入含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d濃度為1.30 mg·mL-1、2.14 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL，按照“2.2.2”項下方法平行制備，按“2.2.3”項下的色譜方法測定，測得柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的平均回收率分別為100.87%，100.96%，RSD值分別為1.78%，3.01%，表明該方法的準(zhǔn)確性良好。結(jié)果見表3。

表3 柴胡皂苷a、d加樣回收實驗

2.3 樣品的含量測定

樣品測定結(jié)果見表4。

表4 柴胡樣品信息以及柴胡皂苷含量測定結(jié)果(%)

4 討論

柴胡含有的皂苷類成分在柴胡屬大多數(shù)種類中都以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為主[5]，因此《中華人民共和國藥典》和日本藥局方(來源于三島柴胡B.falcatum)均用柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總量作為柴胡的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。從本文的研究結(jié)果看，a+d總量，種植北柴胡為0.46%～1.28%，甘肅種植竹葉柴胡為0.88%～1.90%，均高于或者較大幅度高于的《中華人民共和國藥典》(2015年版)規(guī)定的不低于0.3%的標(biāo)準(zhǔn)，這也是竹葉柴胡一直在市場流行，被市場接納和廣泛應(yīng)用的原因之一。由于北柴胡和竹葉柴胡的種植產(chǎn)量大約在50～70 kg，產(chǎn)量較低，因此市場藥材常保留較長一段莖，影響了皂苷的含量，也是近年來市場柴胡檢驗不合格的主要原因之一。藏柴胡的a+d總量為2.03%～3.95%(野生和種植之間差異不明顯)，大約是北柴胡含量的3～4倍，藏柴胡的種植產(chǎn)量達(dá)200 kg以上，藥材形態(tài)和其他柴胡差異較大(根長、柔軟、皮部比例大)，易于辨認(rèn)，各地種植面積仍舊在擴(kuò)大中，本研究組調(diào)查獲知2016年種植面積不少于2000 hm2。基于柴胡皂苷本身也是毒性成分[6]，本研究組的動物實驗也表明，相同生藥量北柴胡未呈現(xiàn)毒性，而服用藏柴胡的小鼠具有明顯的中毒癥狀(未發(fā)表)，因此藏柴胡的使用應(yīng)該慎重。

竹葉柴胡為四川等地方標(biāo)準(zhǔn)收載，雖然皂苷含量符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，但不應(yīng)在全國流通，現(xiàn)在已經(jīng)成為柴胡藥材主流來源，應(yīng)盡快進(jìn)行系統(tǒng)評價。

[1] 方偉，楊印軍，郭寶林，等.藏柴胡中三萜皂苷類成分的研究[J].中國中藥雜志，2016，41(7)：1251-1252.

[2] Fang W，Yang Y J，Guo B L，et al.Anti-influenza triterpenoid saponins(saikosaponins)from the roots ofBupleurummarginatumvar.stenophyllum[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2017，27：1654-1659.

[3] 袁伯川，李文東，馬永生，等.柴胡屬藥用植物的分子鑒定及市售柴胡藥材的質(zhì)量調(diào)查[J].藥學(xué)學(xué)報，2017(1)：162-171.

[4] 肖培根.新編中藥志.第1卷[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：794.

[5] Pan S L，Pan S L.Bupleurum species：scientific evaluation and clinical applications.[M].Boca Raton：CRC Press 2006.

[6] 黃幼異，黃偉，孫蓉.柴胡皂苷對肝臟的藥理毒理作用研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(17)：298-301.