程菲， 姜紅堃

先天性心臟病是最常見的出生缺陷，為嬰幼兒非感染性死亡的首要原因，占主要先天發(fā)育畸形的1/3[1]。心臟的形成過程十分復(fù)雜，由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起，遺傳率達55%～65%。胚胎心臟發(fā)育過程中的任何紊亂均可導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。人類TBX1基因定位于22q11.21，為染色體22q11.2微缺失中關(guān)鍵基因[2-3]，參與心臟、耳、甲狀腺,尤其是肺動脈干基部心肌的發(fā)育[2，4]。該基因主要表達于第二心區(qū)，且以劑量依賴效應(yīng)的方式調(diào)節(jié)心臟流出道的發(fā)育，單倍劑量不足是引起22q11.2微缺失綜合征患者心臟發(fā)育缺陷的重要原因[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β2基因(transforming growth factor beta 2，Tgfb2)是高度保守的TGFp超家族成員之一，具多種生物學作用。RXRA基因敲除小鼠中Tgfb2基因表達升高，心肌細胞凋亡增加，從而導(dǎo)致胚胎心臟流出道發(fā)育異常，推測Tgfb2基因可能是圓錐動脈干畸形的致病易感基因[5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胚胎心肌細胞系TBX1基因干擾后，差異表達芯片預(yù)測結(jié)果提示Tgfb2基因表達增高。為進一步明確二者之間的關(guān)系，本研究擬將TBX1-siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠胚胎心肌細胞系H9C2中，檢測干擾后Tgfb2基因mRNA的表達水平，以期探討二者之間的關(guān)系及在心臟發(fā)育及先天性心臟病發(fā)病中的作用。

1 材料及方法

1.1 主要試劑及材料 大鼠胚胎心肌細胞H9C2購自中國科學院細胞庫；胎牛血清和DMEM購自Gibco；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連保生物有限責任公司；SYBR Green PCR Master mix購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 大鼠胚胎心肌細胞系H9C2常規(guī)在DMEM高糖培養(yǎng)基(10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素)中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)。0.25%的胰酶(磷酸鹽緩沖液配制)消化傳代。根據(jù)處理因素不同，將細胞分為NC-siRNA組和TBX1-siRNA組。siRNA的設(shè)計與合成Negative Control、TBX1-siRNA由上海艾博思生物技術(shù)公司設(shè)計與合成。NC-siRNA：上游引物5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′,下游引物5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′；TBX1-siRNA：上游引物5′-CCG ACU AUA UGC UGC UCA UTT-3′，下游引物5′-AUG AGC AGC AUA UAG UCG GTT-3′。

1.3 轉(zhuǎn)染細胞 常規(guī)培養(yǎng)的H9C2細胞，轉(zhuǎn)染前一天調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL，以每孔2 mL接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，加入轉(zhuǎn)染混合液前，用磷酸鹽緩沖液清洗。采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染。首先在兩個無菌Eppendorf管中，加入250 μL無抗生素、無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，然后分別加入5 μL轉(zhuǎn)染劑和5 μL siRNA，混勻，室溫放置5 min，再將兩管內(nèi)容物混合，室溫放置20 min。將混合物加至接種細胞的孔中，均勻分散。每孔加入1 500 μL無抗生素DMEM高糖培養(yǎng)基，混合均勻，繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h后，磷酸鹽緩沖液清洗，換含血清、無抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后換正常DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后檢測干擾效率。

1.4 細胞總RNA提取 將細胞用磷酸鹽緩沖液清洗2次，加入TRIzol試劑1 mL；室溫靜置5 min，用加樣器吹打，收集在1.5 mL Eppendorf管內(nèi)；加氯仿0.2 mL，渦旋振蕩15 s，室溫放置2～3 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將無色上清移入另一新管；加入異丙醇0.5 mL混勻，室溫放置10 min，使RNA沉淀；4 ℃、12 000 r/min離心10 min棄上清；加75%乙醇(焦碳酸二乙酯水配制)1 mL，渦旋漂洗1次；4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清；空氣干燥15 min,沉淀溶于0.01%焦碳酸二乙酯水，取少量用于濃度及純度測定，其余分裝后置-70 ℃保存；測定RNA濃度。

1.5 cDNA合成 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈，反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實時定量PCR法(qRT-PCR)檢測心肌組織TBX1及Tgfb2的mRNA表達

1.6.1 引物設(shè)計與合成 應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，所用引物序列見表1。

表1 引物序列

引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.6.2 qRT-PCR SYBR Green PCR Master mix(美國Applied Biosystems公司)染料法行TBX1基因及Tgfb2基因qRT-PCR擴增。反應(yīng)體系如下：cDNA 0．5 μL；2×SYBR Green PCR Master mix 12.5 μL；引物(上下游引物的終濃度各為900 nmol/L) 1.0 μL；ddH2O 11.0 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min→95 ℃ 10 min→(92 ℃ 15 s→56.5 ℃ 1 min)×40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，校正每個樣本的Ct，采用thermal cycler軟件包計算△Ct值，以2-△△Ct計算基因表達。實時熒光定量PCR儀(7500型)由美國Applied Biosystems公司提供。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測心肌細胞TBX1 mRNA的表達 H9C2細胞轉(zhuǎn)染TBX1-siRNA 48 h后為(0.22±0.02)，與NC-siRNA(0.99±0.02)比較，TBX1 mRNA表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(t=46.000，P<0.05)。

2.2 qRT-PCR檢測心肌細胞Tgfb2 mRNA的表達 H9C2細胞轉(zhuǎn)染TBX1-siRNA 48 h后為(2.19±0.01)，與NC-siRNA(1.00±0.01)比較，Tgfb2 mRNA表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-145.745，P<0.05)。

3 討論

心臟是胚胎發(fā)育過程中最早形成的器官，其發(fā)育涉及多個基因的先后表達及細胞的分化、遷移、轉(zhuǎn)化、增殖等過程?；虻木_調(diào)控是心臟正常形成的保障，其間的遺傳或環(huán)境因素引起的任何紊亂均可導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。先天性心臟病可因心臟結(jié)構(gòu)及血流動力學異常而導(dǎo)致身體運動耐力下降、腦發(fā)育延遲、肺動脈高壓、心臟擴大、心功能衰竭、艾森曼格綜合征、血栓栓塞、亞急性細菌性心內(nèi)膜炎、心律失常，甚至死亡[2-4]。

TBX1基因是Tbox轉(zhuǎn)錄因子家族成員，前期研究發(fā)現(xiàn)TBX1基因主要表達在內(nèi)胚層的咽弓組織，調(diào)控心臟神經(jīng)嵴細胞的正常遷移，促進第二生心區(qū)細胞的增殖，對主、肺動脈隔發(fā)育有調(diào)節(jié)作用[6]，這表明在心臟流出道發(fā)生過程中TBX1基因起到了關(guān)鍵作用。TBX1基因功能出現(xiàn)異常、表達過高、表達過低均可導(dǎo)致心臟圓錐動脈干畸形。已在先天性心臟病患兒有研究顯示TBX1基因核苷酸發(fā)生變異、基因單拷貝出現(xiàn)重復(fù)、缺失都可引起心臟圓錐動脈干畸形[7-8]。目前人們對TBX1基因的研究限于TBX1基因編碼區(qū)的核苷酸變異[9]或基因缺失、重復(fù)等方面[10]，對TBX1基因表達調(diào)控異常的研究則很少。為進一步尋找TBX1基因的下游基因，課題組前期研究將TBX1-siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠胚胎心肌細胞系H9C2中，采用SurePrint G3 Rat GE 8*60KMicroarray檢測分析技術(shù)篩選出表達上調(diào)基因755個，表達下調(diào)基因240個。根據(jù)分析結(jié)果，結(jié)合心臟發(fā)育相關(guān)基因文獻，選取表達變化明顯的Tgfb2基因，對其進行深入研究。設(shè)計此基因的引物，收集轉(zhuǎn)染TBX1 siRNA后48 h的H9C2細胞系，進行RNA提取，qRT-PCR檢測干擾后觀察此基因的表達水平。本研究擬通過檢測TBX1基因干擾后Tgfb2基因表達變化探討TBX1基因參與心臟發(fā)育及先天性心臟病發(fā)生的可能途徑。

Tgfb2主要表達在心臟的心內(nèi)膜墊組織，可促進房室管和流出道的內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化成心內(nèi)膜墊細胞，抗Tgfb2抗體可以有效地抑制內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)化[11]。有趣的是Tgfb2表達在整個胚胎心臟發(fā)育過程中均可檢測到，而在成人心臟中幾乎檢測不到[12]。目前也有研究認為Tgfb2不僅參與心臟內(nèi)皮間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化，也是誘導(dǎo)神經(jīng)嵴細胞由心臟流出道遷移的趨化因子[13-14]。該基因敲除小鼠可出現(xiàn)右室雙流出道、房室管畸形等多種圓錐動脈干畸形[5]。研究表明，異位RA信號抑制Tgfb2信號通路在心肌早期表達，這是建立正常心室大動脈連接的關(guān)鍵形態(tài)之一[15]。

心臟從開始發(fā)育到最終成熟、成熟后的功能維護，是一個整體、動態(tài)、極其復(fù)雜且精細的調(diào)控過程。多種轉(zhuǎn)錄因子參與其關(guān)鍵過程，但具體機制如上游調(diào)控信號通路及下游靶基因則知之甚少。本研究采用實時定量PCR法檢測TBX1干擾效率后Tgfb2基因mRNA的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tgfb2基因表達增高，與差異表達芯片預(yù)測結(jié)果相符。推測TBX1基因可能通過調(diào)控Tgfb2基因的表達參與心臟發(fā)育及先天性心臟病發(fā)生。對TBX1基因及Tgfb2基因的深入研究有望為產(chǎn)前診斷及遺傳干預(yù)提供理論依據(jù)及潛在的治療靶標。下一步課題組將深入探討TBX1基因調(diào)控Tgfb2基因表達的分子生物學途徑。

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