李雯曦

【摘要】 目的：觀察煙草煙霧暴露人氣道上皮細(xì)胞（16HBE）后，發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）樣改變。方法：（1）以不同濃度（5～50 μg/mL）CSC刺激16HBE 7 d，用CCKit-8檢測細(xì)胞總體活性，篩選最佳濃度。（2）用CSC最大活性影響濃度刺激16HBE 7 d，觀察細(xì)胞形態(tài)改變，經(jīng)Western-blot法和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志物E鈣黏蛋白（E-cad）及EMT標(biāo)記物1型膠原（COL1）、波形蛋白（Vimentin）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)水平。結(jié)果：（1）不同濃度CSC刺激后，16HBE在

10 μg/mL時(shí)OD值最高，為（2.562±0.045）。各濃度間OD值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）經(jīng)10 μg/mL CSC刺激后，部分16HBE形態(tài)由鵝卵石狀向長梭形、多角形或星形改變。（3）Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組COL1、MMP-9的蛋白表達(dá)量分別為（0.566±0.011）和（0.463±0.003），高于對(duì)照組（0.272±0.020）和（0.201±0.023），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而E-cad蛋白表達(dá)量則明顯低于對(duì)照組，分別為（0.301±0.041）和（0.591±0.068），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（4）細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組COL1、Vimentin和MMP-9蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組（P<0.05）；而E-cad蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：經(jīng)CSC刺激后，16HBE可出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化樣改變。

【關(guān)鍵詞】 煙草煙霧凝集物； 氣道上皮細(xì)胞； 上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化

【Abstract】 Objective：To observe the epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells（16HBE） exposed to cigarette smoke.Method：Cells were stimulated by cigarrette smoke condensate（CSC） with different concentrations（5-50 μg/mL） for 7 days，then chosen the optimal concentration by cell counting kit-8.Western blot and Immunofluorescence method were used to estimate the expression levels of E-cad，type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 in 16HBE induced with CSC （10 μg/mL） for 7 days.Result：16HBE manifested a morphological characteristic of loss of cell-cell contact and elongated shape，after 7 days induced with CSC.The level of E-cad downregulated in the experimental group[Western blot（0.301±0.041） vs （0.591±0.068），P<0.05].In contrast，upregulations in expression of type 1 collagen[Western blot （0.566±0.011） vs （0.272±0.020），P<0.05] and MMP-9[（0.463±0.003） vs （0.201±0.023），P<0.05] were observed in the presence of the experimental group，compared with the control group.Immunofluorescence analysis showed that after a 7-day exposure to CSC，E-cad protein was lost whereas type 1 collagen，Vimentin and MMP-9 proteins were acquired.Conclusion：CSC exposure can induce EMT-like process in human airway epithelial cells.

【Key words】 Cigarette smoke condensate； Bronchial epithelial cell； Epithelial-mesenchymal transition

First-authors address：Guangzhou First Peoples Hospital，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.008

氣道重塑是慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）的主要病理特征和引起不可逆性氣流受限的主要原因之一[1]，其中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）與氣道重構(gòu)密切相關(guān)[2]，EMT通過使氣道壁中的成纖維細(xì)胞增加，從而參與氣道重構(gòu)。吸煙是公認(rèn)的導(dǎo)致COPD發(fā)病和不可逆氣流受限進(jìn)展的最為重要的致病因素[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧凝集物（Cigarette Smoke Condense，CSC）能誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）發(fā)生類似EMT的改變[4]。由此推斷，EMT可能是吸煙致COPD氣道重構(gòu)的重要機(jī)制之一。CSC可能經(jīng)由EMT獲得成纖維細(xì)胞樣表型，促進(jìn)氣道重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究將16HBE暴露于CSC后，通過觀察其對(duì)16HBE細(xì)胞形態(tài)的影響及其EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的改變，為EMT在煙草煙霧暴露致COPD氣道重構(gòu)中的可能作用進(jìn)行初步研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 采用由廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供的人正常氣道上皮細(xì)胞株（Human Bronchial Epittielial Cell，16HBE）。美國GIBCO公司生產(chǎn)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）。日本同仁化學(xué)研究所生產(chǎn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCKit-8）試劑。Western blot發(fā)光試劑盒為美國Millipore公司產(chǎn)品，GAPDH兔源性多克隆抗體購于美國Biovision公司，E-cad、COL1及MMP-9抗體購自美國SantaCruz公司，Vimentin抗體和核染色液DEPI為Sigma公司產(chǎn)品，辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗及辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購于北京華肽先鋒生物科技公司，Alexa Fluor488標(biāo)記（綠色熒光）羊抗小鼠IgG工作液及Alexa Fluor594標(biāo)記（紅色熒光）羊抗兔IgG工作液均購自美國生命公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)分成兩組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組為未經(jīng)任何處理的16HBE，實(shí)驗(yàn)組即CSC刺激組。各組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取其平均值。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CSC的制備 用于CSC制備的香煙由紅云紅河煙草有限公司生產(chǎn)，長為84 mm，直徑為8 mm，焦油含量12 mg/支，煙堿含量1.2 mg/支。將內(nèi)附玻璃纖維濾膜（Cambridge filter pad，其粗糙面朝向過濾嘴一端）的過濾器兩邊連上膠管，一端連接一支香煙后點(diǎn)燃，另一端接上60 mL注射器。將吸入的煙霧有規(guī)律地推進(jìn)過濾器和注射器。一共抽吸2支香煙，每支煙吸5 min，負(fù)壓吸引。抽吸完畢，卸下膜置于皿中，用1 mL移液槍將100%DMSO滴加于膜上，溶解凝聚物，滴加后搖晃25 min，用槍頭將溶解液吸盡，所得溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，移入離心管中，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，用1 mL的100%DMSO重懸后稱重（重懸前已稱得1 mL的100%DMSO質(zhì)量），溶解前后DMSO質(zhì)量相減，得出溶解后凝集物的質(zhì)量（g）。把凝集物溶液配成10 mg/mL作為CSC原液，分裝，置于-80 ℃保存，備用。

1.3.2 CCKit-8法檢測細(xì)胞活性 進(jìn)行干預(yù)前將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，接種密度為1.5×104個(gè)/孔，使得次日進(jìn)行干預(yù)時(shí)細(xì)胞融合達(dá)60%。24 h后，將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗2次，分別加入不同濃度的CSC后繼續(xù)培養(yǎng)7 d。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，然后向培養(yǎng)板加入CCK8溶液（10 μL/每孔），放入5%CO2和37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后取出，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測量各孔的光吸收值（OD值）。根據(jù)各個(gè)孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞活性（%），細(xì)胞活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD均值-空白孔OD均值）/（對(duì)照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。OD值的測量精度為小數(shù)點(diǎn)后三位，按單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 EMT有關(guān)指標(biāo)檢測 干預(yù)前24 h將細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為1×105個(gè)/孔，使得次日進(jìn)行干預(yù)時(shí)細(xì)胞融合達(dá)60%。加入10 μg/mL的CSC繼續(xù)培養(yǎng)7 d。Western-blot法測定：收集細(xì)胞提取蛋白，蛋白定量后，以20 μg/孔上樣，將樣本經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離膠進(jìn)行分離后，將膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，條帶放入3%脫脂奶粉TBST（1%的Tween20-Tris緩沖液）中，放置搖床1 h即封閉結(jié)束。加入一抗前先按比例稀釋，小鼠抗人E-cad和兔抗人COL1按1∶1000用3%BSA稀釋，小鼠抗人MMP-9按1∶500用3%BSA稀釋，內(nèi)參兔源性多克隆抗體GAPDH按1∶10 000用3%BSA稀釋，然后孵育4 ℃過夜。一抗孵育結(jié)束，室溫下用TBST洗4次，每次5 min，再用TBS洗1次，每次

5 min。加二抗（辣根酶標(biāo)羊抗鼠IgG，1∶10 000或辣根酶標(biāo)羊抗兔IgG，1∶10 000）室溫下孵育40 min，TBST和TBS洗如前，化學(xué)增敏發(fā)光法顯影。應(yīng)用Image J軟件圖像分析系統(tǒng)獲得各條帶光密度值，蛋白質(zhì)的相對(duì)含量以目的蛋白與內(nèi)參條帶光密度的比值表示，按計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測法：將細(xì)胞接種于12孔板，刺激7 d后，將細(xì)胞取出，用PBS液洗3次，加入1∶1甲醇丙酮混合液，室溫下20 min，然后用PBS洗3次，每次5 min，加入0.5%的Triton X-100，室溫10 min；加入5% BSA液室溫30 min后，吸盡BSA封閉液，分別滴加稀釋一抗即小鼠抗人E-cad抗體（1∶50）、兔抗人COL1抗體（1∶100）、小鼠抗人Vimentin抗體（1∶50）及小鼠抗人MMP-9抗體（1∶200），

-4 ℃過夜。陰性對(duì)照組用PBS液代替上述一抗進(jìn)行反應(yīng)。用0.5%的Triton X-100于脫色搖床上沖洗細(xì)胞6次，每次5 min后，加入Alexa Fluor488標(biāo)記（綠色熒光）羊抗小鼠IgG工作液（1∶250）或Alexa Fluor594標(biāo)記（紅色熒光）的羊抗兔IgG工作液（1∶250），避光條件下室溫40 min。0.5%的Triton X-100洗同前，加入稀釋核染色液DEPI（1∶1000），室溫15 min，避光。0.5%的Triton X-100洗3次，每次5 min，取作好標(biāo)記的干凈普通載玻片，其上滴加抗熒光淬滅劑（Invitrogen公司）10 μL，小心夾出爬片，細(xì)胞面朝下置于有抗淬滅劑的載玻片上，

-4 ℃避光過夜。運(yùn)用Axio Imager Z2顯微掃描分析系統(tǒng)，在400倍高倍鏡視野下進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

2 結(jié)果

2.1 不同梯度濃度CSC刺激下16HBE細(xì)胞活性檢

測 實(shí)驗(yàn)第一步：首先從較寬濃度（5×10-3～50 μg/mL）

篩選出對(duì)細(xì)胞有效影響范圍濃度。由表1可見，CSC在5 μg/mL對(duì)16HBE細(xì)胞有明顯促增殖作用（F=274.61，P<0.05），在50 μg/mL對(duì)其活性有顯著抑制作用（F=94.10，P<0.05），因此進(jìn)一步細(xì)化有效刺激濃度，范圍在5～50 μg/mL，刺激7 d后再行CCKit-8檢測。實(shí)驗(yàn)第二步：從細(xì)化后的有效刺激濃度篩選出最佳刺激濃度。由表2可見，CSC在10 μg/mL時(shí)OD值達(dá)到峰值（F=122.69，P<0.05），在此峰值以后OD值下降（F=298.65、445.28、401.18，P<0.05），故將10 μg/mL作為最佳刺激濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 CSC刺激后16HBE形態(tài)學(xué)檢測 經(jīng)倒置顯微鏡下觀察，對(duì)照組16HBE呈現(xiàn)上皮細(xì)胞典型的鋪路石狀形態(tài)，細(xì)胞間緊密連接，其形態(tài)是立體的，稍微凸起的，見圖1；而經(jīng)10 μg/mL CSC刺激7 d后，16HBE細(xì)胞間連接明顯減少，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，變?yōu)殚L梭形、多角形或星形，見圖2（刺激組中選取EMT樣改變最典型區(qū)域）。

2.3 CSC刺激后EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá) Western blot法檢測，由表3及圖3可見：10 μg/mL 實(shí)驗(yàn)組E-cad蛋白表達(dá)量（0.301±0.041）較之對(duì)照組（0.591±0.068）明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.462，P<0.05）；COL1蛋白表達(dá)量（0.566±0.011）較之對(duì)照組（0.272±0.020）明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.622，P<0.05）；MMP-9蛋白表達(dá)量（0.463±0.003）較之對(duì)照組（0.201±0.023）明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.974，P<0.05）。

2.4 CSC刺激后EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測 由圖4～11可見：16HBE細(xì)胞經(jīng)10 μg/mL

CSC刺激后，與對(duì)照組相比，E-cad蛋白表達(dá)量減少（綠色熒光在胞膜著色減少），COL1蛋白表達(dá)量增加（紅色熒光在胞漿著色增加），Vimentin蛋白表達(dá)量增加（綠色熒光在胞漿著色增加），MMP-9蛋白表達(dá)量增加（綠色熒光在胞漿著色增加）。

3 討論

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種具有氣流受限特征的可以預(yù)防和治療的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展。氣道重構(gòu)（Airway Remodeling）是COPD主要病理特點(diǎn)之一，結(jié)果可引起氣道阻塞和肺的彈性回縮力下降，在氣流受限中扮演非常重要的角色。COPD氣道重塑的特征包括鱗狀和杯狀細(xì)胞的化生、黏液腺的肥大和上皮下的纖維化，其中以纖維化為最主要病變[5]。

吸煙已被公認(rèn)為COPD發(fā)病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。一般認(rèn)為，煙草煙霧進(jìn)入氣道后首先引起氣道上皮的防御反應(yīng)，導(dǎo)致許多炎癥細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、上皮細(xì)胞等）的集聚活化，并通過自分泌和旁分泌方式釋放各種細(xì)胞因子、炎癥因子和介質(zhì)和蛋白酶作用于氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞，引起氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞的形態(tài)和功能的變化。最近研究指出，在吸煙的COPD患者中，其氣道網(wǎng)狀基底膜斷裂較之不吸煙的正常對(duì)照更為明顯，上皮細(xì)胞穿過斷裂的基底膜并分化成為肌纖維細(xì)胞[6]，然而關(guān)于CSC通過何種機(jī)制誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生纖維化，從而參與COPD氣道重構(gòu)的研究甚少。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指在胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移或組織纖維化過程中發(fā)生的上皮細(xì)胞脫黏附而轉(zhuǎn)變成具遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象[7-9]。其病理變化主要包括破壞后缺陷的上皮修復(fù)、過多的纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞，膠原的過度產(chǎn)生和纖維化的發(fā)生[10]。EMT作為COPD氣道重塑的重要機(jī)制之一，近年來越來越受到重視[11-14]。其與肺纖維化關(guān)系密切，是肺纖維化局部成纖維細(xì)胞的重要來源[15]。由于EMT，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為活動(dòng)的成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)展成為肌成纖維細(xì)胞，使纖維細(xì)胞數(shù)量增加[2]，從而參與氣道重構(gòu)。最近報(bào)道指出，CSC能誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞發(fā)生類似EMT的改變[4]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在CSC刺激下，A549（人肺腺癌細(xì)胞）能夠呈現(xiàn)轉(zhuǎn)分化表型[16]。最近研究報(bào)道，香煙煙霧提取物可誘導(dǎo)正常人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）發(fā)生EMT[17]。由此推測，CSC可能誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變，從而使氣道上皮細(xì)胞獲得成纖維細(xì)胞樣表型，促進(jìn)氣道重構(gòu)發(fā)展。因此，EMT可能是吸煙致COPD氣道結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要機(jī)制之一。

正常的上皮細(xì)胞表型具有結(jié)構(gòu)和功能上的極性，細(xì)胞之間緊密連接，其中E鈣黏蛋白（E-cadherin）是粘附連接的主要成分，特別是上皮細(xì)胞的連接[18]。在EMT過程中，細(xì)胞與細(xì)胞間接觸減少，細(xì)胞的連接被拆卸，E鈣黏蛋白從細(xì)胞連接中移位，表達(dá)減少，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白和β-連環(huán)蛋白連接減少，細(xì)胞角蛋白丟失，出現(xiàn)間充質(zhì)和肌成纖維細(xì)胞特有標(biāo)志如波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白等[19]。在纖維化過程中，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）形成和降解的生理學(xué)平衡被打亂，與基質(zhì)流動(dòng)和生長因子激活有關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶（如MMP-2、MMP-9）均顯示上調(diào)[20]。本研究選擇幾個(gè)有代表性的，與EMT改變密切相關(guān)的指標(biāo)（如MMP-9、1型膠原）進(jìn)行檢測，從研究結(jié)果可以看出，煙草煙霧暴露于人氣道上皮細(xì)胞（16HBE）后，能刺激其發(fā)生類似EMT的改變，這與文獻(xiàn)[4]的報(bào)道一致。刺激后的16HBE雖然沒有真正成為成纖維細(xì)胞，但從其形態(tài)變化、EMT標(biāo)志物表達(dá)變化上分析，整體傾向于向成纖維細(xì)胞發(fā)展。然而，人體是一個(gè)復(fù)雜的有機(jī)體，而EMT又是一非常復(fù)雜的過程，上皮細(xì)胞短期暴露不可能完全轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，所以在本研究中只能看到其向成纖維細(xì)胞改變的趨勢。由此，進(jìn)一步開展其體內(nèi)試驗(yàn)的研究非常有必要。本實(shí)驗(yàn)表明，CSC刺激16HBE細(xì)胞7 d后，無論是細(xì)胞形態(tài)還是基因表達(dá)都向EMT樣的改變發(fā)展，標(biāo)記物表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變均符合EMT樣的轉(zhuǎn)變，這可能為香煙煙霧暴露致COPD氣道重塑的發(fā)病機(jī)制提供線索。但由于香煙及其煙霧中含有3800多種化合物，其有害物質(zhì)組分復(fù)雜，關(guān)于煙草煙霧何種成分在其中發(fā)揮主要作用，研究甚少。尼古丁是煙草中的主要致成癮成分，且在香煙煙霧中的含量較高，最近有研究推測[21]，尼古丁可能通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化參與吸煙所致COPD患者氣道重構(gòu)，因此關(guān)于其有害成分的體外試驗(yàn)研究仍有待進(jìn)一步開展。endprint

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（收稿日期：2017-03-27） （本文編輯：程旭然）endprint