趙歡，張伯序，薛圣倫，王一梟，楊大佐，周一兵

(大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

巖蟲Marphysa sanguinea隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門Annelida、多毛綱Polychaeta、磯沙蠶科Eunicidae、巖蟲屬M(fèi)arphysa，是三大洋暖水中廣泛分布種，棲息于潮間帶和潮下帶的泥沙、礫石底質(zhì)、有機(jī)質(zhì)沉積豐富的海區(qū)，在中國黃海、渤海、東海和南海均有分布。巖蟲個(gè)體肥大、營養(yǎng)豐富，是魚類、甲殼類等經(jīng)濟(jì)物種的優(yōu)質(zhì)天然餌料，同時(shí)也被視為最珍貴的海洋游釣餌料之一。巖蟲經(jīng)濟(jì)價(jià)值不斷提升，導(dǎo)致人們對其過度采捕，自然資源日漸枯竭。因此，開展巖蟲的人工繁育及種質(zhì)資源保護(hù)研究勢在必行。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對于巖蟲的研究，多集中在人工繁育及室內(nèi)養(yǎng)殖方面[1]，此外，對其形態(tài)學(xué)[2]、生理學(xué)[3]、發(fā)育學(xué)[4]和天然產(chǎn)物多肽的抗癌功能[5]等方面的研究也有報(bào)道。筆者曾利用ISSR開展了不同地理位置巖蟲遺傳多樣性的研究[6]，在此基礎(chǔ)上，本研究中以COⅠ序列分析方法，研究了中國黃、渤海域和南海海域5個(gè)群體巖蟲的遺傳多樣性和遺傳分化，揭示了中國沿海巖蟲自然群體的遺傳多樣性，并探討了群體間的親緣關(guān)系，旨在為巖蟲人工繁育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用巖蟲為2012—2013年于遼寧大連、遼寧興城、山東乳山和廣西北海4個(gè)海域采集樣品(圖1)，其中廣西北海采集了2個(gè)群體，共5個(gè)群體，每個(gè)群體各15尾樣品。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將采集到的樣品從尾部剪取2～3 cm，裝入凍存管中并編號，放入冰箱 (-20℃)中冷凍，以備DNA的提取。

1.2.2 樣品DNA的提取 使用寶生物DNA提取試劑盒 (TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit)，按照其說明書步驟操作進(jìn)行。樣品在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行檢測，用紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度后，于4℃下保存?zhèn)溆谩?.2.3 PCR擴(kuò)增與測序 從NCBI上檢索出巖蟲的COⅠ序列 (注冊號為GQ497547.1)，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)一對引物，上游引物序列 COⅠ-F： 5′ACGMGTBCCSCTRTTTGT 3′，下游引物序列 COⅠ-R：5′ATTGTTGCYAGTCABCTAA 3′。用該引物預(yù)擴(kuò)增目的片段長度為444 bp。 COⅠ-PCR 反應(yīng)體系 (共25 μL)： 2×Taq Plus PCR Master Mix 12 μL(Tiagen)， 上、 下游引物 (10 μmol/L) 各為 1.25 μL， DNA 模板 10 ng，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下循環(huán)變性45 s，46℃下退火復(fù)性30 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存。反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳上檢測拍照和比較，挑選較好的PCR產(chǎn)物送大連寶生物公司進(jìn)行雙向測序。

圖1 采樣地點(diǎn)Fig.1 Sample locations of rock worm Marphysa sanguinea

1.3 數(shù)據(jù)處理

將通過雙向測序所得到的COⅠ序列在NCBI上進(jìn)行Blast同源性比對，證實(shí)所獲得的基因片段確實(shí)為線粒體COⅠ基因。應(yīng)用Vector NTI軟件參考測序所得電泳圖譜對序列進(jìn)行整理，去除兩端因測序所造成的不準(zhǔn)確堿基。應(yīng)用DnaSP 5計(jì)算各群體樣本核苷酸組成、GC含量、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性 (π)、平均核苷酸差異(K)、Tajima's D值和Fu's Fs值[7]。對各群體COⅠ序列進(jìn)行核苷酸不配對分布分析并制圖。用Arlequin 3.11軟件計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)Fst[8]，并通過分子方差分析 (AMOVA)分析群體內(nèi)和群體間的遺傳變異。采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行群體間的聚類分析，并應(yīng)用Bootstrap(重復(fù)次數(shù)1000)檢驗(yàn)聚類樹各分支置信度，繪制UPGMA聚類圖，選取多毛綱、磯沙蠶科、巖蟲屬M(fèi)arphysa的Marphysa cf.hentscheli作為外參種群 (GenBank登錄號：GQ497551.1)。單倍型聚類樹同樣應(yīng)用MEGA 5.0軟件進(jìn)行繪制，采用Bootstrap(重復(fù)次數(shù)1000)檢驗(yàn)各分支置信度，繪制NJ鄰接樹[9]。應(yīng)用Network軟件繪制各單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征及單倍型多樣性分析

將測序所得到的全部57條COⅠ序列應(yīng)用軟件Victor NTI中的Align X程序進(jìn)行比對和整理，去除兩端不可信堿基，得到長度為374 bp的同源序列，經(jīng) Blast同源性分析，與巖蟲線粒體 DNA COⅠ序列 (GenBank登錄號：GQ497547.1)一致性高達(dá)99%，確定為巖蟲COⅠ序列。對這57個(gè)巖蟲個(gè)體的COⅠ序列進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)有堿基的插入和缺失。共檢測到多態(tài)性位點(diǎn)78個(gè)，其中簡約信息位點(diǎn)59個(gè)，單核苷酸突變位點(diǎn)19個(gè)。COⅠ序列中有46個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換，26個(gè)發(fā)生顛換，另有6個(gè)位點(diǎn)既有轉(zhuǎn)換又有顛換。根據(jù)Nei等[11]的研究，物種間序列的變異位點(diǎn)基本上是轉(zhuǎn)換多于顛換，本試驗(yàn)結(jié)果與其相符。57條COⅠ序列平均堿基含量：A＝27.0%，T＝29.6%，C＝25.9%，G＝17.5%，G+C含量為43.4%，低于A+T含量 (56.6%)，符合線粒體COⅠ基因的一般特點(diǎn)[12]。

從表1可見：5個(gè)群體的57個(gè)個(gè)體共出現(xiàn)了9種單倍型，其中單倍型Hap8出現(xiàn)次數(shù)最多，為15次，但僅出現(xiàn)于廣西兩個(gè)群體之中；單倍型Hap5僅出現(xiàn)于乳山群體，單倍體Hap6和Hap7則僅出現(xiàn)于興城群體中。各群體中乳山群體擁有的單倍型種類最多，分別為Hap1～Hap5，而廣西兩個(gè)群體均僅有Hap8和Hap9兩種單倍型。

表1 巖蟲5個(gè)群體COⅠ單倍型分布Tab.1 Distribution of nine haplotypes in five populations of rock worm Marphysa sanguinea

各群體的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)等遺傳參數(shù)指標(biāo)如表2所示。從表2可見：乳山群體單倍型多樣性最高 (0.822)，大連單倍型多樣性群體最小 (0.295)；各群體核苷酸多樣性為0.001 17～0.047 84，其中，乳山群體最高，廣西兩個(gè)群體均偏低?？傮w上看，5個(gè)群體的巖蟲單倍型多樣性為0.830，核苷酸多樣性為0.097 73，巖蟲整體水平的遺傳多樣性較高。

表2 各群體的單倍型多樣性Hd、核苷酸多樣性π和平均核苷酸差異KTab.2 Haplotype diversity(Hd)， nucleotide diversity(π)and average number of nucleotide differences(K)of each population

2.2 不同地理群體的遺傳距離及分化系數(shù)

巖蟲5個(gè)群體內(nèi)及群體間的Kimura-2參數(shù)遺傳距離如表3所示。從表3可見，群體內(nèi)遺傳距離為0.001 2～0.053 1，其中，廣西B群體最小，乳山群體最高；群體間的遺傳距離為0.001 2～0.179 4，廣西兩個(gè)群體間的遺傳距離最小，僅為0.001 2，而廣西兩個(gè)群體與其他3個(gè)群體間的遺傳距離均較遠(yuǎn)，其中與興城的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.179 4。

表3 巖蟲群體內(nèi)及群體間的遺傳距離Tab.3 Genetic distance within-population and amongpopulation of rock worm Marphysa sanguinea

5個(gè)群體巖蟲群體間的遺傳分化系數(shù)及基因流如表4所示。從表4可見，除了乳山與興城群體間、廣西兩群體間的遺傳分化系數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)外，其他各群體間均產(chǎn)生了較大的遺傳分化 (P＜0.01)。其中，大連群體與廣西兩個(gè)群體的遺傳分化系數(shù)最大，達(dá)到了0.604 52和0.638 86，而乳山與興城群體間的遺傳分化系數(shù)為負(fù)值，說明這兩個(gè)群體間不存在遺傳分化。

通過分子方差分析 (AMOVA)所得結(jié)果如表5所示，其中，有40.26%的遺傳變異發(fā)生在群體間，59.74%的遺傳變異發(fā)生在群體內(nèi)。雖然群體內(nèi)的變異高于群體間的變異，但并不十分明顯。

2.3 遺傳進(jìn)化關(guān)系分析

圖2為應(yīng)用MEGA 5.0軟件對5個(gè)群體的57個(gè)巖蟲個(gè)體建立的UPGMA聚類樹。5個(gè)群體的巖蟲分為兩大類群：乳山 (RS)和興城 (XC)群體聚為一類，之后與大連群體 (DL)又聚在一起，成為一大類群，廣西的兩個(gè)群體 (GXA、GXB)聚為另一大類群。

圖3為應(yīng)用MEGA 5.0軟件對9種單倍型建立的NJ系統(tǒng)樹。從圖3可知，單倍型Hap2～Hap7較密集地聚在一起，而后與單倍型Hap1相聚，成為一大分支，這7種單倍型出現(xiàn)于大連、乳山和興城3個(gè)群體。僅出現(xiàn)于廣西兩個(gè)群體中的單倍型Hap8和Hap9聚類在一起，成為另一大分支。巖蟲個(gè)體間的UPGMA聚類樹和單倍型間的NJ樹顯示的結(jié)果基本一致。

圖4為根據(jù)巖蟲5個(gè)群體中出現(xiàn)的9種單倍型繪制的單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。從圖4可知，這9種單倍型間存在5個(gè)中介節(jié)點(diǎn)，圖中粗線所示為多位點(diǎn)突變，其余細(xì)線均為單位點(diǎn)突變。單倍型Hap2～Hap7處于第一個(gè)集團(tuán)，單倍型Hap1單獨(dú)成為第二個(gè)集團(tuán)，而單倍型Hap8和Hap9處于第三個(gè)集團(tuán)，這也與單倍型NJ樹所顯示的結(jié)果是一致的。

表4 巖蟲不同群體間的遺傳分化系數(shù)Fst及基因流Tab.4 Genetic differentiation and gene flow among 5 populations of rock worm Marphysa sanguinea

圖2 基于線粒體COⅠ序列構(gòu)建的5各群體巖蟲的NJ聚類樹Fig.2 NJ tree of five populations of rock worm Marphysa sanguinea based on mtDNA COⅠsequences

表5 巖蟲群體線粒體COⅠ序列分子變異分析Tab.5 AMOVA analysis of mtDNA COⅠsequences inrock worm Marphysa sanguinea

圖3 巖蟲線粒體COⅠ序列不同單倍型NJ樹Fig.3 Neighbor-joining tree of different haplotypes in rock worm Marphysa sanguinea based on COⅠsequences

圖4 巖蟲單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.4 Haplotype network from all haplotypes of rock worm Marphysa sanguinea based on COⅠsequences

3 討論

線粒體DNA為嚴(yán)格的母系遺傳，沒有重組及其他遺傳重排現(xiàn)象，后代能夠完整保存祖先的遺傳信息，同時(shí)避免了產(chǎn)生混雜遺傳信息的可能。其中，COⅠ是目前應(yīng)用最多且研究比較透徹的基因之一，被廣泛應(yīng)用于魚類和甲殼類等的系統(tǒng)進(jìn)化研究[13-14]。線粒體DNA屬細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)，但在有性生殖中，精子對細(xì)胞質(zhì)貢獻(xiàn)的可能性不足0.004%。線粒體DNA一個(gè)個(gè)體就可以代表一個(gè)母系集團(tuán)，有效種群大小為核DNA兩性遺傳的1/4，故較少的樣本就能反映群體結(jié)構(gòu)[15]。但也有報(bào)道指出，樣本量過少會低估種群的遺傳多樣性水平[16]。本試驗(yàn)中進(jìn)行COⅠ序列分析時(shí)的樣本數(shù)量定為15尾，實(shí)際測序獲得的COⅠ序列每個(gè)群體均大于10尾。從分析結(jié)果來看，所得數(shù)據(jù)基本能夠真實(shí)地反映出群體遺傳多樣性水平，但所獲得的單倍型種類較少。這種情況有可能與本研究中樣本數(shù)量較少有關(guān)。

3.1 巖蟲的遺傳多樣性

在COⅠ序列分析方法中，評價(jià)遺傳多樣性的參數(shù)以單倍型多樣性 (Hd)和核苷酸多樣性 (π)為主要指標(biāo)。根據(jù)線粒體基因序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性可將海洋生物的遺傳多樣性分為4種類型[14]：低Hd(＜0.5) 和低 π (＜0.5%)，高Hd(＞0.5) 和低π (＜0.5%)，低Hd(＜0.5) 和高π (＞0.5%)， 高 Hd(＞0.5) 和高 π (＞0.5%)。 5個(gè)巖蟲群體中，除了大連群體和廣西B群體外，均屬于高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性類型。5個(gè)巖蟲群體中遺傳多樣性最高的是乳山群體，其單倍型多樣性為0.822，核甘酸多樣性為0.047 84；遺傳多樣性最低的是大連群體，其單倍型多樣性為0.295。根據(jù)Grant等[17]提出的4個(gè)假設(shè)，較低的Hd值和π值提示群體可能經(jīng)歷了近期的瓶頸效應(yīng)或奠基者效應(yīng)，推測大連群體的遺傳多樣性較低的原因可能與溢油事故的發(fā)生具有相關(guān)性。2010年7月大連新港發(fā)生輸油管爆炸事件，大量原油泄漏入海，造成黃海、渤海海區(qū)重度原油污染，這勢必對這一海區(qū)內(nèi)的海洋生物造成影響[18]。沉降于水底的油類分解產(chǎn)生的硫化氫等毒物，會造成底棲生物大量死亡。這種生存環(huán)境的巨大災(zāi)難性變化所引起的瓶頸效應(yīng)，很有可能對大連近岸的巖蟲種群造成嚴(yán)重影響，使群體遺傳多樣性下降。

從巖蟲5個(gè)群體遺傳多樣性的聯(lián)合分析來看，5個(gè)群體的巖蟲單倍型多樣性為0.830，核苷酸多樣性為0.097 73，表明巖蟲群體遺傳多樣性處于中等水平。近年來，隨著巖蟲經(jīng)濟(jì)價(jià)值不斷提升，巖蟲自然群體被大量采捕，然而較大的資源量仍然可以維持巖蟲較高的遺傳多樣性。巖蟲群體這種高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特點(diǎn)表明，物種在近期可能經(jīng)歷了一個(gè)由較小的有效群體快速增長為大種群的過程。

3.2 巖蟲群體遺傳分化

遺傳距離是評價(jià)群體遺傳變異的主要指標(biāo)。5個(gè)群體中廣西兩個(gè)群體間的遺傳距離最小，僅為0.001 2，而廣西兩個(gè)群體與其他3個(gè)群體間的遺傳距離均較遠(yuǎn)，其中與興城的距離最遠(yuǎn)，為0.179 4。廣西兩個(gè)群體與其他3個(gè)群體間的遺傳距離均大于0.01，表明廣西群體與其他3個(gè)群體間有明顯分化。這可能是由于海域相距甚遠(yuǎn)，地理屏障導(dǎo)致群體基因交流受阻。巖蟲具有底棲穴居的生活習(xí)性，其種群的擴(kuò)散能力較弱，長期的地理隔離，以及其自身的生活繁殖方式導(dǎo)致廣西群體與其他群體間存在較大程度的遺傳分化。廣西兩群體遺傳距離小于0.01，表明這兩個(gè)群體間遺傳差異較小，兩個(gè)群體間可能存在頻繁的基因交流。不同群體間的遺傳分化系數(shù) (表4)也證實(shí)了廣西兩群體與其余3個(gè)群體距離較遠(yuǎn)，而廣西的兩個(gè)群體間未有明顯的遺傳分化。

從不同個(gè)體間UPMGA聚類樹來看，5個(gè)群體聚為兩大類：第一類為大連群體 (DL)、興城群體(XC)和乳山群體 (RS)，其中乳山群體 (RS)和興城群體 (XC)親緣關(guān)系更近，先聚在一起，而后與大連群體 (DL)聚在一起；第二大類是廣西北海的兩個(gè)群體 (GXA、GXB)。同時(shí)，單倍型NJ系統(tǒng)樹的結(jié)果也符合這一推論，表明廣西北海群體與其他3個(gè)群體間存在較遠(yuǎn)親緣關(guān)系。從單倍型角度分析，出現(xiàn)于大連群體中的單倍型Hap1～Hap3在乳山群體中均有發(fā)現(xiàn)，但單倍型Hap1在乳山群體中所占比例僅為20%，而在大連群體中所占比例則高達(dá)84.6%，從單倍型NJ樹來看，單倍型Hap1也只是第一大支的一個(gè)分支，并未與單倍型Hap2～Hap7發(fā)生密集聚類。推斷這一單倍型可能受到環(huán)境選擇的影響，成為存在于大連群體中的主要單倍型，并存在繼續(xù)進(jìn)化的潛力。由選擇和瓶頸效應(yīng)所形成的專有的單倍型可能會大大促進(jìn)樣本種群間的遺傳分化[19]。

基因交流和繁育方式是影響群體遺傳結(jié)構(gòu)的最重要因素[20]，此外，Crisp[21]通過其研究也指出，海洋無脊椎動(dòng)物的幼體發(fā)育模式和浮游能力對其遺傳結(jié)構(gòu)影響非常顯著。巖蟲具有底棲穴居的生活習(xí)性，其幼體的浮游期較短且浮游能力較差，這就使得種群的擴(kuò)散能力較弱，進(jìn)而導(dǎo)致群體間產(chǎn)生較大程度的遺傳分化。因此，巖蟲群體目前這種遺傳結(jié)構(gòu)，可能是各群體間長期的地理隔離，其自身的生活繁殖方式，以及近期環(huán)境變化所產(chǎn)生的瓶頸效應(yīng)共同作用所造成的。

[1] 楊大佐，周一兵，陳愛華，等.巖蟲室內(nèi)人工繁育的初步研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2011，30(9)：572-574.

[2] 毛昕，朱麗巖，鄭家聲.巖蟲消化管組織學(xué)、組織化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的初步研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，37(6)：961-967.

[3] Garcês J P，Pereira J.Effect of salinity on survival and growth of Marphysa sanguinea Montagu(1813)juveniles[J].Aquaculture International，2011，19(3)：523-530.

[4] 于海志，朱麗巖，鄭家聲.巖蟲的性腺發(fā)育和生殖周期[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2005，12(6)：669-674.

[5] 潘衛(wèi)東，劉向輝，戈峰.海洋巖蟲抗菌肽篩選及抗癌活性的初步研究[J].中國海洋藥物，2004，23(3)：1-6.

[6] Zhao Huan，Wang Yixiao，Yang Dazuo，et al.An analysis of genetic diversity in Marphysa sanguinea from different geographic populations using ISSR polymorphisms[J].Biochem Syst Ecol，2016，64：65-69.

[7] Librado P，Rozas J.DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J].Bioinformatics，2009，25(11)：1451-1452.

[8] Excoffier L，Laval G，Schneider S.Arlequin(version 3.0)：an integrated software package for population genetics data analysis[J].Evol Bioinform Online，2005，1：47-50.

[9] Nei M.Genetic distance between populations[J].Am Nat，1972，106(949)：283-292.

[10] Bandelt H J，F(xiàn)orster P，R?hl A.Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies[J].Mol Biol Evol，1999，16(1)：37-48.

[11] Nei M，Kumar S.Molecular Evolution and Phylogenetics[M].Oxford：Oxford University Press，2000.

[12] ?？姑?，李煥，呂振明，等.中國沿海7個(gè)長蛸(Octopus variabilis)群體COI基因的遺傳變異研究[J].海洋與湖沼，2010，41(3)：307-314.

[13] 趙琳，張敏瑩，徐東坡，等.2個(gè)地理種群大銀魚COⅠ基因序列變異與遺傳分化[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，31(3)：285-289.

[14] 董鑫，邢坤，隋宥珍，等.基于線粒體COI基因序列的4個(gè)海域口蝦蛄群體的遺傳多樣性研究[J].海洋科學(xué)，2015，39(7)：29-36.

[15] 李建華，王繼文.動(dòng)物線粒體DNA在進(jìn)化遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生物學(xué)通報(bào)，2005，40(2)：5-7.

[16] 閆晗.利用ISSR和COI序列標(biāo)記分析不同地理仿刺參群體的遺傳多樣性[D].大連：遼寧師范大學(xué)，2006.

[17] Grant W S，Bowen B W.Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes：insights from sardines and anchovies and lessons for conservation[J].J Hered，1998，89(5)：415-426.

[18] Lv Ying，Zhang Weidong，Gao Yan，et al.Preliminary study on responses of marine nematode community to crude oil contamination in intertidal zone of Bathing Beach，Dalian[J].Mar Pollut Bull，2011，62(12)：2700-2706.

[19] 蓋珊珊.山東沿海不同地理群體雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)的早期發(fā)育及遺傳多樣性研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2012.

[20] Hamrick J L，Godt M J W，Sherman-Broyles S L.Gene flow among plant populations：evidence from genetic markers[M]//Hoch P C，Stephenson A G.Experimental and Molecular Approaches to Plant Biosystematics.Saint Louis：Missouri Botanical Garden Press，1995：215-232.

[21] Crisp D J.Genetic consequences of different reproductive strategies in marine invertebrates[M]//Battaglia B，Beardmore J A.Marine Organisms：Genetics，Ecology，and Evolution.New York：Plenum，1978：257-273.