李春艷，吳會(huì)民，李嬋，劉肖蓮，白曉慧，張先光，付志茹，姜巨峰

(1.天津市水產(chǎn)研究所天津市觀賞魚技術(shù)工程中心，天津300221；2.鐵嶺市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，遼寧鐵嶺112000；3.天津嘉禾田源觀賞魚養(yǎng)殖有限公司，天津301809)

血鸚鵡俗稱紅財(cái)神、財(cái)神魚、發(fā)財(cái)魚，該魚最早來自中國臺(tái)灣，由鱸形目Perciformes、慈鯛科Cichlidae的紅頭麗體魚 Vieja synspila(Hubbs，1935)♀和橘色雙冠麗體魚Amphilophus citrinellus(Gunther，1864)♂雜交而來。其體色紅艷，體型圓潤(rùn)，嘴呈心形，笑口常開，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，已成為世界范圍內(nèi)重要的淡水經(jīng)濟(jì)觀賞魚類。中國血鸚鵡魚的養(yǎng)殖區(qū)域主要集中于天津、上海、廣東、海南等地。天津地區(qū)年產(chǎn)量可達(dá)10 940萬尾，產(chǎn)值約為9788萬元，占天津市觀賞魚年產(chǎn)量的9.95%，占觀賞魚產(chǎn)值的13.98%[1]，有效帶動(dòng)了周邊地區(qū)飼料、漁藥、水族和運(yùn)輸?shù)刃袠I(yè)的發(fā)展。血鸚鵡屬于遠(yuǎn)緣雜交子代，遺傳性狀不穩(wěn)定，遺傳差異較大，養(yǎng)殖過程中要選擇褪色完全、體型圓潤(rùn)的個(gè)體作為商品魚，尖頭及不褪色或褪色不完全的血鸚鵡會(huì)在養(yǎng)殖過程中被淘汰，所以血鸚鵡尖頭率的高低會(huì)直接影響企業(yè)及養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。

在現(xiàn)有血鸚鵡繁育過程中，養(yǎng)殖戶往往只通過魚體外形挑選親魚，缺乏對(duì)親本的種質(zhì)評(píng)估環(huán)節(jié)。加上親本的重復(fù)利用，使得繁育的血鸚鵡質(zhì)量不穩(wěn)定，經(jīng)常出現(xiàn)尖頭率高、褪色率低的現(xiàn)象，給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，關(guān)于血鸚鵡的研究主要集中于水質(zhì)調(diào)控、養(yǎng)殖技術(shù)、飼料添加劑等方面[2-5]，對(duì)血鸚鵡親本及家系的遺傳評(píng)估尚且較少，僅見劉肖蓮等[6]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)血鸚鵡3個(gè)全同胞家系進(jìn)行遺傳多樣性及經(jīng)濟(jì)性狀連鎖分析。因此，亟需開展血鸚鵡及其父母本的種質(zhì)遺傳評(píng)估，以期為血鸚鵡分子育種提供參考。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定且呈共顯性遺傳等特性，該技術(shù)目前已廣泛用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建和分子育種等研究中[7-12]。本研究中，利用6對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)2種體型的血鸚鵡家系進(jìn)行種質(zhì)遺傳評(píng)估和分析，旨在為血鸚鵡親本組配及分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用紫紅火口與紅魔鬼魚取自天津嘉禾田源觀賞魚養(yǎng)殖有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 挑選性腺發(fā)育良好、體色鮮艷、健康無損傷的紫紅火口 (♀)與紅魔鬼 (♂)進(jìn)行配對(duì)，自然產(chǎn)卵，待其產(chǎn)卵完成后將附著受精卵的瓦片放入孵化缸 (40 cm×30 cm×30 cm)中，微流水條件下孵化 (30.0±0.5)℃。當(dāng)血鸚鵡苗種長(zhǎng)至1.5 cm時(shí)轉(zhuǎn)入苗種培育缸 (65 cm×40 cm×40 cm)中培育，投喂橈足類、枝角類或配合飼料(粗蛋白質(zhì)含量為52%)。培育期間定期換水，以保持水質(zhì)清新，pH為7.5～8.1，溶解氧保持在5.0 mg/L以上，水溫為28～32℃，光照強(qiáng)度為1000 Lx。當(dāng)血鸚鵡生長(zhǎng)至3～4 cm時(shí)體色開始轉(zhuǎn)色，體色由黑色漸變?yōu)榈偕驕\黃色。當(dāng)體長(zhǎng)達(dá)到5 cm時(shí)，根據(jù)頭型、體型、體色和嘴型進(jìn)行苗種挑選，抽樣統(tǒng)計(jì)尖頭和圓頭比率。選取完全褪色且尖頭率低的家系 (YT)和尖頭率高的家系 (JT)作為試驗(yàn)對(duì)象，每個(gè)家系隨機(jī)選取30尾個(gè)體，測(cè)量其全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高并計(jì)算體長(zhǎng)/體高和全長(zhǎng)/體高。剪取鰭條晾干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取及引物合成 本試驗(yàn)中所用微衛(wèi)星標(biāo)記參照劉肖蓮等[6]開發(fā)的6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，標(biāo)記名稱、引物序列、退火溫度和產(chǎn)物分布范圍如表1所示。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用血液DNA提取試劑盒 (德國，QIAGEN)提取基因組DNA。提取完成后采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的質(zhì)量，于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增及基因分型 PCR反應(yīng)體系 (共20 μL)： 10×PCR buffer(Mg2+)2 μL， dNTP Mixture 1.6 μL， 正、 反向引物 (10 μmol/L) 各 1 μL， 5 U/μL Taq 酶0.5 μL， 50 ng/μL 基因組 DNA 1 μL，用ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃下預(yù)變性5 min；95℃下變性30 s，退火30 s(最佳退火溫度見表1)，72℃下延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3730基因分析儀 (Applied Biosystems)進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳，以GS500LIZ為長(zhǎng)度內(nèi)參分析產(chǎn)物長(zhǎng)度，用3730 Data collection和GeneMapper 4.0軟件讀取微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物基因片段數(shù)據(jù)，并根據(jù)大小確定各樣本在微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型。

表1 微衛(wèi)星引物序列及擴(kuò)增情況Tab.1 Sequence and amplification of microsatellite loci

1.3 數(shù)據(jù)處理

用PopGene 3.2軟件統(tǒng)計(jì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù) (Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度 (He)、香農(nóng)信息指數(shù) (I)和固定系數(shù) (Fis)，使用PIC CALC 0.6軟件計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量 (PIC)，并檢測(cè)各參數(shù)的平均值。使用SPSS 21.0軟件對(duì)兩種體型的血鸚鵡家系進(jìn)行性狀比值的正態(tài)分布檢驗(yàn) (Kolmogorov-Smimov法)和判別分析。利用廣義線性模型(GLM)進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的最小二乘分析，篩選與經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記，建立模型如下：

其中：y為性狀；u為群體平均值；g為第i個(gè)基因型的效應(yīng)；e為殘差。利用Duncan多重比較法分析與經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)不同基因型間的差異，并基于Permutation檢驗(yàn)，確認(rèn)基因型效應(yīng)的顯著性水平 (10 000次)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血鸚鵡家系性狀正態(tài)分布

通過紫紅火口 (♀)與紅魔鬼 (♂)進(jìn)行配組共構(gòu)建9個(gè)血鸚鵡全同胞家系。當(dāng)血鸚鵡體長(zhǎng)達(dá)到4～5 cm時(shí)，進(jìn)行一次挑選，統(tǒng)計(jì)尖頭情況，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果從中選取尖頭 (尖頭率84%)和圓頭(尖頭率10%)兩個(gè)家系進(jìn)行后續(xù)分析。

血鸚鵡家系體長(zhǎng)/體高和全長(zhǎng)/體高呈現(xiàn)連續(xù)變異的特點(diǎn)，采用SPSS 21.0軟件中的單樣本Kolmogorov-Smimov檢驗(yàn)方法，檢驗(yàn)兩個(gè)家系性狀比值的頻率是否符合正態(tài)分布，結(jié)果見表2。經(jīng)檢驗(yàn)，YT家系的體長(zhǎng)/體高、全長(zhǎng)/體高及JT家系的體長(zhǎng)/體高符合正態(tài)分布 (P＞0.05)，而JT家系的全長(zhǎng)/體高不符合正態(tài)分布 (P＜0.05)。從兩個(gè)家系的體長(zhǎng)/體高的分布頻率 (表3)可知，這兩個(gè)家系的血鸚鵡體型差異較大，YT家系的30尾個(gè)體的體長(zhǎng)/體高為1.1～1.5，JT家系中93.3% 的個(gè)體體長(zhǎng)/體高均大于1.5。兩個(gè)血鸚鵡家系的性狀比值分布見圖1。

表2 血鸚鵡家系的性狀比值的正態(tài)分布檢驗(yàn)Tab.2 Gaussian distribution of measurable traits of blood parrot fish families

表3 血鸚鵡家系個(gè)體體型分布情況Tab.3 Distribution of body type of blood parrot fish families ind.

圖1 兩個(gè)血鸚鵡家系的性狀比值分布Fig.1 Scatter diagram of trait ratio in two blood parrot fish families

2.2 判別分析

按照體長(zhǎng)/體高對(duì)血鸚鵡進(jìn)行分組，比值大于1.50的定義為尖頭 (28尾)，比值小于1.5的定義為圓頭 (32尾)。利用體長(zhǎng)/體高(X1)和全長(zhǎng)/體高(X2)的特征值構(gòu)建判別公式為

在進(jìn)行判別分析時(shí)，將所測(cè)2個(gè)特征值代入上述判別公式，所得函數(shù)值為正值即為尖頭血鸚鵡，負(fù)值則為圓頭血鸚鵡。據(jù)此對(duì)所有觀測(cè)樣本按照上述判別函數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分類 (表4)，YT家系血鸚鵡判別準(zhǔn)確率為100%，JT家系判別準(zhǔn)確率為89.3%，總體平均擬合概率為95%。因此，利用形態(tài)性狀進(jìn)行分類的判別分析成功率高，判別效果較好 (P＜0.01)。

表4 血鸚鵡體型判別分析結(jié)果Tab.4 Results of discriminant analysis of blood parrot fish

2.3 血鸚鵡家系的遺傳多樣性

本研究中，所用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均能在兩個(gè)血鸚鵡家系中擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定的DNA條帶，擴(kuò)增片段大小為174～416 bp。各個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)為 2～4個(gè)，有效等位基因數(shù) (Ne)為1.032～3.908個(gè)，期望雜合度 (He)為 0.031～0.756，觀測(cè)雜合度 (Ho)為0.031～0.969，多態(tài)信息含量 (PIC)為0.030～0.696(表5)。位點(diǎn)Vsac04和位點(diǎn) Vsac06表現(xiàn)為低度多態(tài) (PIC＜0.25)，位點(diǎn)Vsac05(YT家系)表現(xiàn)為高度多態(tài)(PIC＞0.5)，其余位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài) (0.25≤PIC≤0.5)。在固定系數(shù) (Fis)方面，兩個(gè)家系的Fis平均值分別為-0.488和-0.367，均表現(xiàn)為雜合子過剩 (Fis＜0)。比較兩個(gè)家系以上遺傳參數(shù)發(fā)現(xiàn)， YT家系的 Ne、 He、 Ho、 PIC、 I和 Fis的平均值均高于JT家系，YT家系的遺傳多樣性較豐富。

表5 血鸚鵡家系在6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性Tab.5 Genetic diversity of 6 microsatellite loci in blood parrot fish families

2.4 微衛(wèi)星標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析

采用SPSS 21.0軟件計(jì)算的GLM模型，對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記和體長(zhǎng)/體高、全長(zhǎng)/體高性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，標(biāo)記Vsac04和Vsac05與這兩個(gè)性狀顯著相關(guān) (P≤0.05)，但Vsac04只有兩個(gè)基因型，不能進(jìn)行多重比較。分子標(biāo)記Vsac05基因型間平均值的多重比較結(jié)果表明 (表6)：含BC基因型個(gè)體的體長(zhǎng)/體高平均值最小 (1.389)，最大為AA等位基因型個(gè)體 (1.745)；含有基因型AA個(gè)體的體長(zhǎng)/體高及全長(zhǎng)/體高平均值顯著高于含AC、AD和BC 3種基因型的個(gè)體，而含BD基因型個(gè)體的體長(zhǎng)/體高平均值顯著高于含BC基因型的個(gè)體 (P＜0.05)，其他基因型個(gè)體體長(zhǎng)/體高及全長(zhǎng)/體高均無顯著性差異 (P＞0.05)。AC、AD、BC基因型只在YT家系中出現(xiàn)，AA和BD在兩個(gè)家系中均有出現(xiàn)，等位基因C(375 bp)是圓頭家系特有的基因。

3 討論

3.1 血鸚鵡體型與分級(jí)挑選

在魚類生產(chǎn)上，通常利用雜種優(yōu)勢(shì)選育具有生長(zhǎng)快或抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良性狀的品種[13-16]。觀賞魚在利用雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行選擇時(shí)則更側(cè)重于選擇體型和體色。血鸚鵡的體型既不像父本也不像母本，作為雜交后代其性狀不穩(wěn)定，即使是全同胞家系，個(gè)體間的體型和體色也差異較大。血鸚鵡正是通過這種“雜種優(yōu)勢(shì)”選育出金剛鸚鵡、元寶鸚鵡、羅漢鸚鵡、麒麟鸚鵡和紅財(cái)神等多個(gè)品種。盡管血鸚鵡雌魚性成熟后可以正常排卵，雄魚卻未觀察到完全能育型的精巢及正常排精的現(xiàn)象，所以血鸚鵡的優(yōu)良性狀較難穩(wěn)定遺傳[17]。因此，本研究中從血鸚鵡形態(tài)學(xué)性狀和遺傳多樣性水平揭示不同體型血鸚鵡家系的種質(zhì)差異，篩選與體長(zhǎng)/體高相關(guān)的分子標(biāo)記，以期為血鸚鵡親本配組提供理論基礎(chǔ)，提高血鸚鵡品種的優(yōu)級(jí)率。

表6 標(biāo)記Vsac05位點(diǎn)不同基因型性狀平均值和多重比較Tab.6 Means and multiple comparisons of traits with different genotypes in locus Vsac05

何麗等[17]對(duì)血鸚鵡體型各性狀間的比例關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)體高/體長(zhǎng)值越接近黃金比例(0.618)的血鸚鵡，觀賞價(jià)值越高。然而，隨著人們的審美標(biāo)準(zhǔn)及觀賞需求的變化，目前，體長(zhǎng)/體高越接近1.0的血鸚鵡品級(jí)越高，價(jià)格也越貴。按照血鸚鵡的國標(biāo)分級(jí)挑選標(biāo)準(zhǔn)，血鸚鵡按照體長(zhǎng)/體高可以分為AAAA級(jí)、AAA級(jí)、AA級(jí)、A級(jí)和B級(jí)魚[18]。本研究中YT家系的體長(zhǎng)/體高平均值為1.359，比值為1.1～1.2的個(gè)體占樣本數(shù)的3.3%，1.2～1.3的個(gè)體占樣本數(shù)的 20.0%，1.3～1.4的個(gè)體占樣本數(shù)的53.3%，1.4～1.5的個(gè)體占樣本數(shù)的23.3%，以上個(gè)體按照分級(jí)挑選標(biāo)準(zhǔn)分別屬于AAA級(jí)、AA級(jí)、A級(jí)和B級(jí)魚，均可作為商品魚繼續(xù)培養(yǎng)。JT家系的體長(zhǎng)/體高平均值為1.795，比值大于1.5的個(gè)體為28尾，占樣本數(shù)的93.3%，基本上均屬于淘汰魚。性狀測(cè)量結(jié)果表明，YT家系的性狀顯著優(yōu)于JT家系。本研究中利用SPSS 21.0軟件對(duì)兩個(gè)家系進(jìn)行判別分析，得到的判別公式能較好地區(qū)分兩個(gè)家系，綜合判別率高達(dá)95%，可以為血鸚鵡分級(jí)挑選提供參考。

3.2 血鸚鵡家系的遺傳多樣性水平

基因決定性狀，基因差異是個(gè)體性狀差異的主要根源。微衛(wèi)星標(biāo)記是目前進(jìn)行動(dòng)物分子輔助育種研究最常用的分子標(biāo)記之一[19-21]。遺傳多樣性水平高低是評(píng)價(jià)種質(zhì)資源的重要指標(biāo)，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測(cè)雜合度和多態(tài)信息含量等均為反映群體遺傳多樣性水平高低的參數(shù)，這些參數(shù)值越大，遺傳多樣性水平越高，遺傳變異越豐富。本研究中采用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，除標(biāo)記Vsac04和Vsac06以外，其他標(biāo)記均已被證實(shí)處于中高等態(tài)多態(tài)水平且擴(kuò)增良好[22]，能夠用于血鸚鵡遺傳多樣性分析及種質(zhì)資源評(píng)估。固定系數(shù)(Fis)可反映觀測(cè)雜合度和期望雜合度間的平衡關(guān)系，F(xiàn)is越接近于零，基因型的分布就越接近平衡狀態(tài)，F(xiàn)is＞0表明雜合子缺失，F(xiàn)is＜0表明雜合子過剩。本研究結(jié)果顯示，兩個(gè)家系均表現(xiàn)為雜合子過剩 (Fis＜0)。綜上所述，YT家系等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測(cè)雜合度、多態(tài)信息含量和香農(nóng)信息指數(shù)的平均值均高于JT家系，表明圓頭家系的遺傳多樣性水平較高，變異較豐富。

3.3 微衛(wèi)星標(biāo)記與性狀的連鎖分析

分子標(biāo)記與性狀的連鎖分析就是對(duì)個(gè)體的位點(diǎn)基因型與表型性狀進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著則說明標(biāo)記與性狀的基因存在連鎖遺傳，在育種過程中可通過篩選性狀相關(guān)的分子標(biāo)記來縮短育種時(shí)間和提高選種準(zhǔn)確性[6]。劉肖蓮等[6]通過標(biāo)記連鎖分析發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記Vsac05和Vsac06與體長(zhǎng)極顯著相關(guān)，標(biāo)記Vsac02與體高/體長(zhǎng)極顯著相關(guān)。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，體長(zhǎng)/體高是影響血鸚鵡分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和價(jià)格的最重要因素，因此，本研究中采用SPSS 21.0軟件的GLM模型，對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記和血鸚鵡體長(zhǎng)/體高、全長(zhǎng)/體高兩個(gè)特征值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，標(biāo)記Vsac04和Vsac05與體長(zhǎng)/體高、全長(zhǎng)/體高顯著相關(guān)。關(guān)聯(lián)分析表明，一個(gè)性狀可以受多個(gè)基因控制，或者一個(gè)基因位點(diǎn)可以影響多個(gè)性狀的表達(dá)。這一點(diǎn)與劉肖蓮等[6]試驗(yàn)結(jié)果相同，即在性狀關(guān)聯(lián)分析中存在 “多因一效”和 “一因多效”現(xiàn)象。但由于所選試驗(yàn)群體不同，不同群體的遺傳背景不同，因此，群體遺傳多樣性和關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果也不完全相同。對(duì)分子標(biāo)記Vsac05進(jìn)行多重比較表明，其基因型AC、AD、BC只在YT家系中出現(xiàn)，在育種實(shí)踐中可以作為優(yōu)先選擇的基因型，等位基因C(375 bp)是圓頭家系特有的基因。含等位基因C(375 bp)個(gè)體的體長(zhǎng)/體高平均值低于其他基因型個(gè)體。在血鸚鵡進(jìn)行育種時(shí)，體長(zhǎng)/體高值越小 (比值越接近于1)，圓頭性狀越明顯，血鸚鵡的等級(jí)和價(jià)格越高。因此，分子標(biāo)記Vsac05可用于血鸚鵡育種，在血鸚鵡親本進(jìn)行組配時(shí)，優(yōu)先選擇含有標(biāo)記Vsac05等位基因C(375 bp)的父母本，使圓頭優(yōu)勢(shì)性狀得到保存和富集，從而提高血鸚鵡魚的優(yōu)級(jí)率。

綜上所述，血鸚鵡體型受多個(gè)基因的遺傳控制，遺傳機(jī)制比較復(fù)雜。目前，關(guān)于血鸚鵡的分子研究尚少，所用的遺傳標(biāo)記更是寥寥無幾。采用高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的方法可以獲得更多與生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)的基因和分子標(biāo)記。因此，還有許多工作亟需進(jìn)一步開展，比如對(duì)血鸚鵡分子標(biāo)記的開發(fā)、生長(zhǎng)調(diào)控和褪色機(jī)制研究等。

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