王友令 袁小遠 孟凱 徐懷英 張玉霞 李莉 亓麗紅 宋敏訓(xùn) 艾武（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東 濟南 250100）

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不同白油佐劑制備的H9N2滅活疫苗在SPF雞上的免疫效果初試驗

王友令 袁小遠 孟凱 徐懷英 張玉霞 李莉 亓麗紅 宋敏訓(xùn) 艾武*（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東 濟南 250100）

為了比較不同廠家的注射用礦物白油佐劑的免疫效果，試驗采用3個不同黏度的國外白油樣品，按照《中華人民共和國獸藥典》進行注射用白油質(zhì)量檢驗、制備3批H9N2油乳劑滅活疫苗，分別以0.3ml/只劑量，胸部肌肉注射接種28日齡SPF雞，接種后14d、21d、28d、35d、42d分別進行疫苗的藥物殘留吸收檢查和血清抗體效價檢測。結(jié)果表明：3種佐劑疫苗的安全性、穩(wěn)定性均良好；應(yīng)用WG40白油佐劑的滅活疫苗，免疫SPF雞產(chǎn)生的H9N2禽流感HI抗體水平優(yōu)于其它兩種佐劑，免疫3周后檢測到的H9N2禽流感抗體水平均合格，WG40確定為最佳白油佐劑。

礦物白油佐劑 運動黏度 H9N2 免疫效果

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)感染禽類后引起的一種疾病綜合癥，包括呼吸道、消化道、產(chǎn)蛋量下降或免疫抑制等疾病，可分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感三類[1]。我國自1994年首次在廣東省分離到H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza viruses, H9N2 subtype AIV)以來，H9N2亞型禽流感病毒仍是當前我國雞群中的主要的低致病性禽流感亞型。H9N2亞型禽流感病毒給我國的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的危害，該病毒不但造成禽呼吸道疾病，還侵害家禽的生殖系統(tǒng)，造成蛋禽產(chǎn)蛋率下降，肉禽生長緩慢，同時易與其他病原微生物混合感染，造成死亡， H9N2亞型禽流感病毒已經(jīng)有廣泛的宿主范圍，包括人類、豬以及家禽[2]。最近在中國H7N9高致病性禽流感的暴發(fā)導(dǎo)致了多人死亡，其中H7N9毒株的六個內(nèi)部基因(PA、NS、PB2、PB1、NP、M)均來自H9N2亞型禽流感病毒[3]。此外，有報道稱國內(nèi)貓和犬也易感H9N2亞型禽流感，由于這些物種在發(fā)達國家和發(fā)展中國家與人類有更親近的關(guān)系，可能會對人的健康造成更大的風險，H9N2亞型禽流感將成為人畜共患傳染病毒的儲蓄庫[4]。預(yù)防和控制禽流感最有效的手段就是免疫接種，目前我國用于禽流感H9N2防控的疫苗多為滅活疫苗，所采用的佐劑多數(shù)為注射用礦物白油佐劑，油乳劑滅活疫苗由于其具有完整的免疫原性和無毒力返祖現(xiàn)象，并且具有免疫效力高，使用安全，持續(xù)時間長等優(yōu)勢，受到了廣大養(yǎng)殖戶的青睞。因此，注射用礦物白油作為一種佐劑被廣泛地應(yīng)用于禽用滅活疫苗生產(chǎn)中。但不同廠家生產(chǎn)的注射用白油佐劑黏度和純度等質(zhì)量不一，因而其應(yīng)激、免疫吸收和抗體消長效果差異較大，直接影響著疫苗的免疫效果[5,6]。本試驗選擇3個不同廠家注射用礦物白油佐劑樣品，嚴格按照油乳劑滅活疫苗制造與檢驗規(guī)程標準，進行H9N2滅活疫苗的制備與檢驗[7]。將檢驗合格的不同廠家注射用礦物白油佐劑滅活疫苗進行SPF雞免疫效果試驗，對免疫雞進行采血分離血清檢測抗體效價，同時剖檢觀察注射部位藥物吸收、殘留情況，通過比較不同廠家注射用礦物白油佐劑的免疫效果差異，為獸醫(yī)生物制品行業(yè)選用合適的礦物白油提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 礦物白油佐劑 不同廠家注射用白油型號分別為WG40、WG50、DDE170，由國內(nèi)兩家不同代理商提供。

1.2 病毒滅活液與標準血清 各項檢驗合格的雞H9N2病毒滅活液由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所無特定病原雞研究室提供。標準H9N2陽性抗原、標準H9N2陽性血清、標準陰性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.3 培養(yǎng)基和藥品 需氧菌培養(yǎng)基、厭氧菌培養(yǎng)基、霉菌培養(yǎng)基等常用培養(yǎng)基由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所制備和保存；吐溫-80、司本-80由廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司提供。

1.4 試驗材料及設(shè)備 28日齡SPF雞，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所無特定病原雞研究室提供。FA25型剪切機，上海弗魯克公司生產(chǎn)。禽用負壓隔離器，蘇州安泰公司生產(chǎn)。

1.5 不同廠家注射用礦物白油質(zhì)量檢測 相對密度、運動黏度、稠環(huán)芳烴、重金屬含量按照《中華人民共和國獸藥典》(2010版)的相關(guān)規(guī)定方法進行檢驗[8]。

1.6 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗制備與檢驗 按照油乳劑滅活疫苗的相關(guān)規(guī)定方法進行制備與檢驗[9]，每個白油樣品制備油乳劑滅活疫苗各250ml。

1.7 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫效果試驗 每個白油樣品H9N2油乳劑滅活疫苗分別以0.3ml/只劑量，胸部肌肉注射接種28日齡SPF雞30只，于接種后14d、21d、28d、35d、42d分別無菌采血10只雞進行血清抗體(HI)效價檢測。同時每組撲殺5只雞進行疫苗的藥物殘留吸收檢查。采用SPSS11.5軟件和GraphPad Prism 5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 注射礦物白油質(zhì)量檢測結(jié)果 不同廠家注射用礦物白油質(zhì)量檢測項目與數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 不同廠家注射用礦物白油質(zhì)量檢驗結(jié)果

由表1可知，對照《中華人民共和國獸藥典》的質(zhì)量標準：運動黏度<7.0的是礦物白油WG40；3種白油稠環(huán)芳烴含量吸光度均小于0.10；重金屬含量3種白油均<10。

2.2 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗的檢驗結(jié)果 3種注射用礦物白油佐劑配制的H9N2滅活疫苗檢驗結(jié)果：物理性狀檢驗合格；疫苗黏度分別是WG40為1.7s、WG50為2.3s、DDE170為2.5s；無菌檢驗、安全檢驗均合格。

2.3 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫 藥物吸收、殘留剖檢結(jié)果見表2。

表2 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗胸部肌肉注射藥物吸收、殘留剖檢結(jié)果

白油組別14d21d28d35d42d WG402/5+,3/5++5/5+1/5-,4/5+2/5-,3/5+4/5-,1/5+ WG505/5++5/5+3/5-,2/5+4/5-,1/5+4/5-,1/5+ DDE1701/5+,4/5++-1/5,4/5+2/5-,3/5+3/5-,2/5+3/5-,2/5+

注：(-)吸收好無殘留物痕跡；(+)藥物殘留為少量的針尖狀的乳白色細小顆粒；(++)藥物殘留為小米粒樣的乳白色顆粒、有綠豆粒大小的肉芽腫1~2 個。

由表2可知，經(jīng)過5次注射部位剖檢檢查藥物殘留情況綜合統(tǒng)計，結(jié)果其白油佐劑吸收較好的順序是：WG40>WG50>DDE170。

2.4 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫HI抗體檢測結(jié)果 將5次血清抗體檢測數(shù)據(jù)經(jīng)過分析處理，其抗體消長情況見附圖。

附圖 不同礦物白油H9N2滅活疫苗免疫抗體消長曲線

由附圖可知：不同礦物白油樣品H9N2滅活疫苗抗體監(jiān)測平均值比較發(fā)現(xiàn)，WG40在接種后14d、21d、28d、35d、42d的抗體均比WG50和DDE170高，且抗體上升快。而WG50和DDE170組在整個免疫期抗體差異不大，從抗體水平看，WG40白油適合用于H9N2油乳劑疫苗的佐劑。

3 討論

（1）免疫佐劑是指與抗原同時或先于抗原使用，能增強機體針對抗原的免疫應(yīng)答能力或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)[10]。選擇佐劑時不僅要考慮其免疫促進作用，也要兼顧佐劑的安全性及佐劑與抗原適當比例配制后疫苗的黏度、穩(wěn)定性等是否符合要求。目前，滅活疫苗尤其是禽用滅活疫苗，通常使用的佐劑是礦物油佐劑，抗體滴度維持時間較長。但是，不同油佐劑對疫苗免疫效果的增強作用可能存在差異[11]。礦物白油佐劑在獸用滅活疫苗上的應(yīng)用研究開始于上世紀80年代，對預(yù)防控制畜禽重大疫病的傳播起到重要作用[12]。注射用礦物白油，其配制的滅活疫苗的共性問題是：如果注射用礦物白油的運動黏度系數(shù)高，則制備的滅活疫苗在免疫注射過程中出現(xiàn)黏稠度較大、注射困難、毒副反應(yīng)較強(過敏)、引起注射部位紅腫、化膿、吸收慢、殘留量高，導(dǎo)致免疫動物生產(chǎn)和生長發(fā)育性能顯著下降等現(xiàn)象；運動黏度系數(shù)過低，則制備的滅活疫苗在免疫注射過程中出現(xiàn)黏稠度較小、吸收過快、毒副反應(yīng)較強(過敏)，黏度過高過低均會引起大的應(yīng)激問題，其本質(zhì)與礦物白油佐劑的內(nèi)在質(zhì)量相關(guān)[13]。（2）本試驗選擇了3種進口油佐劑，與禽流感( H9N2亞型) 病毒液配制成滅活疫苗，免疫接種28日齡的SPF雞均未出現(xiàn)局部腫塊及不良反應(yīng)，說明3 種佐劑的生物兼容性較好，易吸收，無毒副作用。通過對這3種注射用礦物白油樣品質(zhì)量監(jiān)測數(shù)據(jù)、抗體消長數(shù)據(jù)、藥物吸收及殘留量檢測等結(jié)果綜合分析，表明，影響免疫效果的是注射用礦物白油的運動黏度、稠環(huán)芳烴含量、重金屬含量等綜合因素。根據(jù)本試驗研究的3種進口油佐劑配制的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗免疫28日齡SPF雞的效力檢驗結(jié)果表明，不同佐劑制備的滅活疫苗的抗體效價確實存在明顯差異，只有WG40作為佐劑的疫苗，免疫后2周H9N2流感病毒的抗體達到合格水平，其余佐劑則在免疫3周后才能達到合格水平。分析原因，這可能與其運動黏度較低，抗原能夠短時間釋放有一定的關(guān)系。試驗結(jié)果認為WG40白油可以作為30日齡左右育成雞的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗的理想佐劑，但是以WG40為佐劑的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗在產(chǎn)蛋禽上的實際應(yīng)用效果有待進一步試驗驗證。

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（2017–09–28）

畜禽重大疫病防控與高效安全養(yǎng)殖綜合技術(shù)研發(fā)(2016YFD0501600)；山東省2015年度農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目(肉鴨疫病監(jiān)測和防治技術(shù)集成與示范)；山東省中標禽流感疫苗質(zhì)量檢測項目。

S859.79+7

A

1007-1733(2018)02-0003-03