毛念佳，嵇鴻民，許 柯，任洪強(qiáng)，李穎瑜

（南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210046）

氧化亞氮（N2O）是大氣中含量僅次于CO2和CH4的溫室氣體，其在污水生物處理過程中的排放日益受到關(guān)注［1］。美國環(huán)保署報(bào)告稱，污水處理過程中釋放的N2O占總釋放量的3%［2］。IPCC報(bào)告中指出，污水處理廠污水處理過程中大約0.05%～25%的氮被轉(zhuǎn)化成N2O形式釋放，約占全球N2O總排放量的1.2%［3］。因此，深入了解污水處理過程中N2O的產(chǎn)生機(jī)理和減量控制具有重要意義。

周期循環(huán)活性污泥法（cyclic activated sludge system，CASS）是基于SBR工藝的一種新型污水處理技術(shù)，因其系統(tǒng)組成簡單、操作運(yùn)行靈活多變、基建費(fèi)用低和可靠性好等特點(diǎn)，在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用［4-5］，當(dāng)前關(guān)于污水生物脫氮過程中N2O釋放特征的研究主要以SBR、AAO、氧化溝等工藝為主［6-7］，而對(duì)于CASS工藝脫氮過程中N2O的排放及機(jī)理研究較少。

pH作為CASS工藝運(yùn)行中的實(shí)時(shí)控制參數(shù)，對(duì)微生物的代謝活動(dòng)具有重要影響，同時(shí)對(duì)生物脫氮過程中某些物質(zhì)（如游離氨、HNO2等）的存在及濃度產(chǎn)生影響，是控制生物脫氮過程正常進(jìn)行和影響N2O產(chǎn)生量的重要條件。本研究考察了進(jìn)水pH對(duì)CASS工藝過程中N2O排放的影響，并從微生物群落結(jié)構(gòu)、功能基因?qū)用娣治鯪2O產(chǎn)生機(jī)理，旨在為實(shí)際工藝運(yùn)行中N2O的減排提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置與運(yùn)行條件

試驗(yàn)所用CASS反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成，如圖1所示。反應(yīng)器長43 cm、寬11 cm、高15 cm，水面超高5 cm，有效容積為4.66 L。生物選擇區(qū)、缺氧區(qū)和主反應(yīng)區(qū)容積分別為0.25、0.33 L和4.08 L。模擬污水經(jīng)由蠕動(dòng)泵進(jìn)入反應(yīng)器，通過電磁閥控制出水。

圖1 CASS反應(yīng)器示意圖Fig.1 Schematic Diagram of CASS Reactor

本試驗(yàn)采用間歇進(jìn)水，一個(gè)周期包括了進(jìn)水、曝氣、沉淀、排水這四個(gè)階段，運(yùn)行時(shí)間分別為0.8、2、1、1 h，共4.8 h。裝置由電子計(jì)時(shí)器控制開關(guān)，可實(shí)現(xiàn)周期式自動(dòng)連續(xù)運(yùn)行。每周期進(jìn)水1.86 L，出水后剩余體積2.80 L，排水比40%。接種污泥取自南京江心洲污水處理廠，污泥濃度在3 000 mg／L左右；反應(yīng)器末端設(shè)有污泥回流管，污泥經(jīng)回流泵進(jìn)入生物選擇區(qū)，污泥回流率為20%。

1.2 模擬污水

本試驗(yàn)采用模擬污水，組分為：一水合葡萄糖，51 mg／L；蛋白胨，100 mg／L；氯化銨，80 mg／L；磷酸二氫鉀，13 mg／L；七水合硫酸鎂，25 mg／L；二水合氯化鈣，11 mg／L；微量元素濃縮液，0.6 mL ／L。微量元素濃縮液組分為：FeCl3·6H2O，1.50 mg／L；KI，0.18 mg／L；ZnSO4· 7H2O， 0.12 mg／L；H3BO3，0.15 mg／L；MnCl2· 4H2O，0.12 mg／L；CoCl2·6H2O，0.15 mg／L；CuSO4· 5H2O， 0.03 mg／L；Na2MoO4·2H2O，0.06 mg／L；EDTA，10 mg／L。主要營養(yǎng)物質(zhì)濃度為：COD150mg／L，NH＋4_N 21 mg／L，

TN 36 mg／L，TP 3 mg／L，五個(gè)反應(yīng)器進(jìn)水 pH 值分別調(diào)節(jié)為 6.6、7.2、7.8、8.4、9.0。

1.3 分析方法

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

試驗(yàn)采用SYBR Green染料法，對(duì)污泥中反硝化功能基因nirS（編碼的血紅素cd1型亞硝酸還原酶）、nirK（編碼銅型亞硝酸還原酶）、nosZ（N2O還原酶催化中心）進(jìn)行定量分析［9］。以大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2＞0.999），擴(kuò)增程序?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR儀 AB7500（Life Technologies，美國）進(jìn)行，熱循環(huán)過程為：95℃ 3 min，40個(gè)循環(huán)的95℃ 20 s，退火 30 s，72℃延伸 40 s。反應(yīng)體 系為 25 μL，含 12.5 μL 2 ×SYBR?Green PCR Master Mix（Vazyme，中國），2 μL模板 DNA （20 ng／μL），正反向引物各 0.5 μL（20 μmol／L），9.5 μL 無菌超純水，每個(gè)樣品做三個(gè)平行樣。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待測功能基因或細(xì)菌定量，計(jì)算其拷貝數(shù)，如表1所示。

表1 目標(biāo)基因的引物序列及退火溫度Tab.1 Primer Sequences for Target Genes and Corresponding Annealing Temperature

1.5 16S rRNA高通量測序

以FastDNA Spin Kit for soil試劑盒提取污泥DNA，稀釋至20 ng／μL后用于16S rRNA基因V1-V2區(qū)域PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品做四個(gè)平行樣。PCR擴(kuò)增 中 用 到 的 正 向 引 物 序 列 （5′-3′）為AGAGTTTGATYMTGGCTCAG，反向引物序列（5′-3′）為 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCR。擴(kuò)增體系為50 μL，包含 2 × EasyTaq?PCR SuperMix 25 μL，正向和 反 向 引 物 （10 μmol／L）各 1 μL，DNA 模 板2 μL，超純水21 μL。PCR 擴(kuò)增過程為：首先 98℃預(yù)熱5 min，再經(jīng)過擴(kuò)增程序，其中98℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，此擴(kuò)增程序循環(huán)20次，最終72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后將平行樣合并，用E.Z.N.A.TM Cycle-Pure試劑盒（Omega Bio-tek Inc.，USA）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化，再用超微量分光光度儀測定純化樣品濃度和純度。

純化產(chǎn)物送至江蘇中宜金大分析檢測公司進(jìn)行Miseq高通量測序，所得的結(jié)果通過 Sickle軟件，Mothur軟件對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪處理，獲得序列結(jié)果，進(jìn)行多樣本深度歸一化處理后，通過R語言程序（R version 3.1.1）繪制熱圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同進(jìn)水pH條件下氮的轉(zhuǎn)化過程

本研究考察了穩(wěn)定運(yùn)行20 d（2倍污泥齡）后，各反應(yīng)器在不同進(jìn)水pH下一周期內(nèi)濃度變化，結(jié)果如圖2所示。由圖 2可知，進(jìn)水 pH 值為 6.6、7.2、7.8、8.4、9.0時(shí)去除率分別為39.5%、65.1%、82.4%、98.0%、99.7%，TN去除率分別為 37.5%、37.1%、40.3%、42.6%、45.7%。隨著進(jìn)水pH的增加，和TN去除率都上升，pH對(duì)去除效果影響更大。當(dāng)進(jìn)水pH值高于8.4時(shí)，N可基本完全去除。為保證較好的脫氮效果，CASS工藝進(jìn)水pH值最好維持在7.8以上。

由于硝化反應(yīng)的進(jìn)行消耗堿度，pH的提高會(huì)促進(jìn)好氧段硝化反應(yīng)的進(jìn)行。進(jìn)水pH值為9.0時(shí)，曝氣90 min后幾乎所有被完全氧化。當(dāng)進(jìn)水pH值從6.6增加到9.0時(shí)，更多的被硝化菌氧化為最大濃度從9.66 mg／L 增加到 19.70 mg／L。濃度的增多也提高了活性污泥沉淀時(shí)缺氧反硝化速率。因此，TN去除率也隨進(jìn)水pH的提高而有所增加。

2.2 不同進(jìn)水pH條件下N2O的釋放特征

本研究考察了不同進(jìn)水pH下CASS反應(yīng)器曝氣階段N2O排放速率及一周期溶解性N2O濃度變化，結(jié)果如圖3所示。進(jìn)水pH值為6.6～8.4時(shí)，N2O排放速率在曝氣開始時(shí)出現(xiàn)峰值（0.03～0.09 mg N／min），隨后逐漸降低，并保持在較低水平（約0.01 mg N／min）。而當(dāng)進(jìn)水pH值增加到9.0時(shí)，曝氣開始時(shí)N2O排放速率僅為0.01 mg N／min，在曝氣過程中稍有上升，曝氣30 min后N2O排放速率（0.02 mg N／min）高于其他反應(yīng)器。進(jìn)水pH值為9.0的反應(yīng)器溶解性N2O濃度在整個(gè)周期都低于0.1 mg／L。

不同進(jìn)水pH下CASS反應(yīng)器N2O的釋放量、轉(zhuǎn)化率及在沉淀出水階段的產(chǎn)生量如圖4所示。隨著進(jìn)水pH值從6.6提高到9.0，每周期N2O排放量從0.32 mg N／L增加到0.52 mg N／L。不同進(jìn)水pH下N2O轉(zhuǎn)化率差別較小，為6.02%～7.92%，進(jìn)水pH值為6.6時(shí)N2O轉(zhuǎn)化率最低，而進(jìn)水pH值為9.0時(shí)最高。沉淀出水階段的N2O產(chǎn)生量在pH值為6.6～7.8時(shí)隨pH的提高從1.28 mg N增加到7.02 mg N，但隨著進(jìn)水pH的繼續(xù)增加，N2O產(chǎn)生量迅速減少，在進(jìn)水pH值為9.0時(shí)完全沒有N2O產(chǎn)生。

圖2 不同進(jìn)水pH值下反應(yīng)器中污染物濃度變化 （a）6.6；（b）7.2；（c）7.8；（d）8.4；（e）9.0Fig.2 Variation of Pollutant Concentration under Different Influent pH Value（a）6.6；（b）7.2；（c）7.8；（d）8.4；（e）9.0

圖3 不同進(jìn)水pH下曝氣階段N2O排放速率及一周期溶解性N2O濃度變化Fig.3 N2O Emission Rate during Aeration Period and Dissolved N2O Concentration in a Typical Cycle under Different Influent pH Value

圖4 不同進(jìn)水pH下N2O排放特征Fig.4 N2O Emission Characteristics under Different Influent pH Value

當(dāng)前關(guān)于污水處理過程進(jìn)水pH與N2O排放特征關(guān)系的研究不多。Kampschreur等［12］認(rèn)為與其他影響因素相比，pH的影響較小。然而，本試驗(yàn)中pH對(duì)CASS工藝脫氮過程中N2O釋放特征的影響不可忽視。pH最高的反應(yīng)器在硝化過程N(yùn)2O排放速率高于其他反應(yīng)器。Law等［13］的研究表明，在富集氨氧化細(xì)菌的活性污泥反應(yīng)器中，隨著pH值從6.0增加到8.0，硝化過程N(yùn)2O產(chǎn)生量逐漸增加，原因與較高的氨氧化速率相關(guān)。Hynes等［14］研究Nitrosomonas europeae硝化過程中N2O的產(chǎn)生規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，與pH較低的條件相比，在pH值為8.5的有氧條件下，氨氧化細(xì)菌達(dá)到最大的NO及N2O產(chǎn)生速率，此時(shí)N2O產(chǎn)生的最主要來源是NOH的分解作用。劉越等［15］對(duì)短程硝化過程的研究表明，低DO水平下氨氧化速率的提高會(huì)引起N2O產(chǎn)生速率的增加，N2O的產(chǎn)生以羥胺氧化途徑為主。本試驗(yàn)中NO－2濃度極低，較高的氨氧化速率促進(jìn)氨氧化菌反硝化途徑產(chǎn)生N2O的可能性較小，因此進(jìn)水pH的提高促進(jìn)羥胺氧化途徑產(chǎn)生N2O。

2.3 反硝化功能基因豐度分析

不同進(jìn)水pH條件下反硝化功能基因豐度如圖5所示。由圖5可知，進(jìn)水pH值為8.4時(shí)nosZ和nirS基因豐度最高，分別為 3.54×108copies／mL和3.33×108copies／mL。進(jìn)水 pH值為9.0的反應(yīng)器nirK 基因豐度（2.12×107copies／mL）遠(yuǎn)高于其他反應(yīng)器（4.91×106～ 6.97×106copies／mL），而 nirS 基因豐度（1.55×108copies／mL）也較高，僅低于進(jìn)水pH值為8.4的反應(yīng)器。反硝化菌在高pH條件下數(shù)量增加，可能是這兩個(gè)反應(yīng)器的TN去除率高于低pH反應(yīng)器的原因之一。然而，進(jìn)水pH值為9.0的反應(yīng)器nosZ基因豐度并非最高，但在沉淀出水階段卻沒有N2O產(chǎn)生，可能的原因是pH值為9.0的條件沒有促進(jìn)含有nosZ基因的反硝化菌增長，但增強(qiáng)了N2O還原酶的活性。Shu等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)水pH值為4.3～7.8的污水處理廠中，nosZ基因豐度與pH呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與本試驗(yàn)中進(jìn)水pH值為6.6時(shí)nosZ基因豐度高于進(jìn)水pH值為7.2和7.8的結(jié)果接近。

圖5 不同進(jìn)水pH下反硝化功能基因豐度Fig.5 Abundances of Denitrification Functional Genes under Different Influent pH Value

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

本試驗(yàn)利用高通量測序Miseq分析了微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。pH對(duì)變形菌豐度影響較小，不同進(jìn)水pH條件下的反應(yīng)器變形菌含量分別為19.23%～23.93%，如圖6（a）所示。有研究認(rèn)為在亞硝化系統(tǒng)中N2O的產(chǎn)生主要來自為Nitrosomonas的反硝化作用［20］。不同進(jìn)水pH條件下，CASS工藝活性污泥中氨氧化菌（ammoniaoxidizing bacteria，AOB）主要是 Nitrosomonadales，而亞硝酸鹽氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）主要是Nitrospira。隨著進(jìn)水pH的增加，氨氧化菌含量在0.43%～0.63%波動(dòng)，而亞硝酸鹽氧化菌含量則從2.58%增加至3.42%。Shu等［21］采用熒光定量PCR測定6個(gè)污水處理廠活性污泥硝酸鹽氧化菌（Nitrobacter和Nitrospira）的16S rRNA豐度時(shí)，發(fā)現(xiàn)硝酸鹽氧化菌含量也與pH呈正相關(guān)關(guān)系，與進(jìn)水COD濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，pH對(duì)硝酸鹽氧化菌細(xì)胞增殖起重要作用。

圖6 不同進(jìn)水pH條件下微生物群落結(jié)構(gòu)（a）門水平及變形菌綱分布；（b）反硝化菌相對(duì)豐度（＞0.1%）Fig.6 Microbial Community Structure under Different Influent pH Value （a）Distribution in Phylum and Proteobacteria in Class Level；（b）Relative Abundances of Potential Denitrifying Bacteria

不同pH條件下的CASS反應(yīng)器中反硝化菌相對(duì)豐度如圖6（b）所示。試驗(yàn)活性污泥樣品中共檢測到59個(gè)反硝化菌屬，圖6（b）列舉了其中相對(duì)豐度最高的23個(gè)反硝化菌屬（相對(duì)豐度 ＞0.1%）。由圖6（b）可知，進(jìn)水 pH 值為 6.6、7.2、7.8、8.4、9.0 的反應(yīng)器總反硝化菌含量分別為 5.77%、4.16%、4.76%、6.59%、3.89%。優(yōu)勢(shì)反硝化菌為 Dechloromonas（1.36%～4.25%）和 Zoogloea（0.75%～1.26%）。不同pH的反應(yīng)器中Dechloromonas豐度變化較大。在進(jìn)水pH值為7.2～8.4時(shí)，反硝化菌豐度隨pH的增加而增加。進(jìn)水pH值為9.0的反應(yīng)器反硝化菌豐度最低，因此其在沉淀出水階段沒有N2O累積的原因并不是較多完全反硝化的微生物，而是N2O還原酶在高pH條件下活性更高，反硝化過程N(yùn)2O還原速率高于產(chǎn)生速率。由于本試驗(yàn)的反應(yīng)器幾乎沒有亞硝酸鹽產(chǎn)生，即使在進(jìn)水pH值為6.6的反應(yīng)器中對(duì)應(yīng)的游離亞硝酸濃度也極低，反硝化菌的生長繁殖沒有受到較大的抑制，pH對(duì)反硝化菌含量的影響較小。

3 結(jié)論

（2）進(jìn)水pH值為6.6～8.4時(shí)，N2O排放在曝氣開始出現(xiàn)峰值，隨后逐漸降低，并保持較低水平（約0.01 mg N／min）；而進(jìn)水pH值增加到9.0，曝氣開始時(shí)N2O排放速率較小，而后在曝氣過程中稍有提升。隨著進(jìn)水pH值從6.6提高到9.0，每周期N2O排放量從0.32 mg N／L增加到0.52 mg N／L。

（3）進(jìn)水pH值為8.4的反應(yīng)器中nosZ和nirS基因豐度最高，而進(jìn)水pH值為9.0的反應(yīng)器nirK基因豐度最高。高pH條件下反硝化菌的數(shù)量增加，提高了TN去除率。

（4）不同進(jìn)水pH下，污泥中氨氧化菌（AOB）主要是Nitrosomonadales，亞硝酸鹽氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）主要是Nitrospira。隨著進(jìn)水pH的增加，氨氧化菌含量變化不大，而亞硝酸鹽氧化菌含量則從2.58%增加至3.42%。反硝化優(yōu)勢(shì)菌種為Dechloromonas（1.36%～4.25%）和 Zoogloea（0.75%～1.26%），Dechloromonas豐度隨進(jìn)水pH變化較大。

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