楊 琦，王養(yǎng)民，常德輝，張 斌，康菲斐

(解放軍蘭州總醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

腎損傷多見于男性青壯年，在所有外傷中占1%～5%，在腹部損傷中占8%～10%，在泌尿系損傷中最為常見[1]，其中以閉合性腎損傷多見，常伴有其他臟器合并傷，嚴(yán)重者可威脅患者生命。腎損傷經(jīng)保守或微創(chuàng)介入治療后，部分血管再通，但存在缺血再灌注后損傷，是創(chuàng)傷領(lǐng)域亟待解決和研究的課題。腎臟組織中細(xì)胞因子的表達(dá)及相關(guān)治療藥物的研究日益受到人們的關(guān)注。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)可通過細(xì)胞表面復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮多種生物學(xué)功能，在創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成、骨改建、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、器官纖維化以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮重要作用[2]。本研究觀察了閉合性腎損傷新西蘭兔腎臟組織的組織學(xué)表現(xiàn)及腎臟組織中TGF-β1的表達(dá)情況，旨在探討腎臟組織中TGF-β1表達(dá)情況與早期閉合性腎損傷的關(guān)系，為閉合性腎損傷的治療提供新的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗資料

1.1 實(shí)驗動物 健康新西蘭兔36只，雌雄不限，兔齡12～16周，體質(zhì)量1.81～2.60(2.11±0.24)kg，由我院動物實(shí)驗科提供。將36只新西蘭兔隨機(jī)分為正常組4只和創(chuàng)傷組32只，創(chuàng)傷組再根據(jù)不同撞擊高度(30 cm、40 cm、50 cm、60 cm)隨機(jī)分為4個亞組，每組8只。

1.2 試劑 免疫組織化學(xué)試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。BA0290即用型Rabbit anti-TGF-β16 mL；SA1022即用型SABC免疫組化染色試劑盒：5%BSA封閉液12 mL，山羊抗兔IgG親和純化抗體12 mL，SABC 12 mL；AR1022 DAB顯色試劑盒：顯色劑A(DAB×20倍濃縮液)3 mL，顯色劑B(H2O2×20倍濃縮液)3 mL，顯色劑C(TBS緩沖液×20倍濃縮液)3 mL。

1.3 儀器與設(shè)備 小型生物撞擊器，參照BIM-Ⅳ型生物撞擊機(jī)[3](第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所研制)自制，主要由200 g砝碼、聯(lián)塑管、支撐架及動物實(shí)驗臺等組成。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 動物模型建立 創(chuàng)傷組32只進(jìn)行造模，用3%戊巴比妥鈉注射液(1 mL/kg)經(jīng)實(shí)驗兔耳緣靜脈注射，麻醉滿意后用脫毛劑脫去腎區(qū)體毛，將其俯臥位固定于動物實(shí)驗臺上，季肋部墊長方形硬物，根據(jù)不同分組用200 g砝碼(直徑3.0 cm)分別從30 cm、40 cm、50 cm、60 cm高處(以相應(yīng)長度的聯(lián)塑管作為軌道，管道內(nèi)徑3.5 cm)自由落體垂直撞擊實(shí)驗兔左、右側(cè)腎區(qū)，建立不同程度的閉合性腎損傷模型，最后62個腎臟造模成功(有2個腎臟病理檢查未見明確腎損傷)，損傷分級Ⅰ級8個、Ⅱ級11個、Ⅲ級15個、Ⅳ級21個、Ⅴ級7個。

1.4.2 腎臟組織的組織學(xué)觀察 取兔腎臟組織標(biāo)本，HE染色，由同一病理醫(yī)師采用盲法在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織的組織學(xué)表現(xiàn)，病變嚴(yán)重處用高倍鏡觀察。

1.4.3 腎臟組織中TGF-β1表達(dá)觀察 兔腎臟組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以大鼠肝臟標(biāo)本石蠟切片作為TGF-β1陽性表達(dá)對照，以PBS液代替一抗染色作為陰性對照。TGF-β1陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色顆粒著色，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為每張切片的最后判定結(jié)果，并分析創(chuàng)傷組TGF-β1表達(dá)情況與腎損傷分級的關(guān)系。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：組織完全不著色或陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%為弱陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為中等陽性()，陽性細(xì)胞數(shù)>75%為強(qiáng)陽性()。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行分析。等級資料的兩個獨(dú)立樣本比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多個獨(dú)立樣本比較采用Kruskal-WallisH檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎臟組織的組織學(xué)表現(xiàn) 正常組腎包膜完整，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常。創(chuàng)傷組腎包膜下可見大量紅細(xì)胞聚集，部分腎包膜破裂；腎內(nèi)可見片狀出血灶并伴炎細(xì)胞滲出，腎小球及腎小管內(nèi)可見紅細(xì)胞增多；多數(shù)腎小管上皮細(xì)胞扁平，胞漿疏松，部分腎小管上皮細(xì)胞呈空泡樣改變，刷狀緣損傷或脫落；多數(shù)腎小管腔內(nèi)可見淡紅色絮狀物質(zhì)；以上病變均隨著腎損傷分級的升高而加重。

2.2 腎臟組織中TGF-β1表達(dá)情況 正常組腎臟組織中可見少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞胞漿呈淡黃色顆粒著色，TGF-β1陽性表達(dá)率為25.00%(2/8)；創(chuàng)傷組腎臟組織中可見腎小管上皮細(xì)胞胞漿呈棕褐色顆粒著色，TGF-β1陽性表達(dá)率為91.94%(57/62)。創(chuàng)傷組腎臟組織中TGF-β1陽性表達(dá)率明顯高于正常組(Z=3.84，P<0.05)。見表1。

表1 2組腎臟組織中TGF-β1表達(dá)情況 個(%)

2.3 創(chuàng)傷組腎臟組織中TGF-β1表達(dá)情況與腎損傷分級的關(guān)系 腎臟組織中TGF-β1陽性表達(dá)率隨著腎損傷程度的加重而升高(H=27.92，P<0.05)。見表2。

3 討 論

Shiozuru等[4]在葉酸誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷(AKI)模型中觀察到腎遠(yuǎn)端小管和近端小管損傷顯著加重，腎小管擴(kuò)張與萎縮同時存在，而在細(xì)針穿刺引起的創(chuàng)傷性腎損傷模型中可見穿刺區(qū)域出現(xiàn)管狀壞死斑和纖維化進(jìn)展。付剛等[5]在新西蘭兔閉合性腎損傷模型大體標(biāo)本中見腎包膜破裂、腎包膜下血腫、腎實(shí)質(zhì)挫裂傷并血腫形成，光鏡下見腎細(xì)胞發(fā)生不同程度損傷，腎毛細(xì)血管充血，腎小管內(nèi)可見紅細(xì)胞管型和蛋白管型。本實(shí)驗于創(chuàng)傷組腎臟組織中可見近被膜層、腎小球密集區(qū)近皮質(zhì)側(cè)、腎小球密集區(qū)近髓質(zhì)側(cè)的腎小管上皮細(xì)胞病變主要為空泡變性，其中以近被膜層腎小管上皮細(xì)胞病變最為顯著，近髓質(zhì)區(qū)近曲小管上皮細(xì)胞病變主要為顆粒變性，病變較輕，遠(yuǎn)曲小管及直小管病變最輕，同時以上各處病變隨著腎損傷分級的升高而加重，考慮發(fā)生上述變化的原因可能與腎動脈主干由腎門處逐漸分支至近被膜層毛細(xì)血管網(wǎng)呈樹枝狀分布的特點(diǎn)以及損傷發(fā)生后腎臟血流的重新分布密切相關(guān)。

表2 創(chuàng)傷組腎臟組織中TGF-β1表達(dá)情況與腎損傷分級的關(guān)系 個(%)

TGF-β1是由2個結(jié)構(gòu)相同或相近、分子量分別為12.5 kD的亞單位借二硫鍵連接形成的雙體，是一種多功能細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖、分化、創(chuàng)面愈合和腫瘤生成轉(zhuǎn)移等過程中均發(fā)揮重要調(diào)控作用[6]。起初對TGF-β1的生物學(xué)功能研究主要在炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面，近年來發(fā)現(xiàn)TGF-β1對細(xì)胞的生長、分化和免疫功能都具有重要的調(diào)節(jié)作用[7-9]。一般TGF-β1對間充質(zhì)起源的細(xì)胞起刺激作用，而對上皮或神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞則起著抑制作用。近年研究表明，TGF-β1可通過多種信號通路誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，包括Smad通路和非Smad通路，而Smad信號通路是TGF-β1誘導(dǎo)EMT的主要途徑，TGF-β1與其Ⅰ、Ⅱ型受體相結(jié)合引起Smad 2和Smad 3磷酸化，磷酸化的Smads 2/3與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Smad 4配對并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，通過與特定基因調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[10-11]。

TGF-β1是目前公認(rèn)的最為重要的促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的細(xì)胞因子之一，而腎間質(zhì)纖維化又是各種腎臟疾病最終進(jìn)展到腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子及ECM的相互作用，TGF-β1在這一復(fù)雜過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，引起腎間質(zhì)ECM成分沉積，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[12-13]。本實(shí)驗中創(chuàng)傷組腎臟組織中TGF-β1陽性表達(dá)率明顯高于正常組，且TGF-β1陽性表達(dá)率隨著腎損傷程度的加重而升高。提示在閉合性腎損傷發(fā)生后，TGF-β1作為一種損傷因子，對腎臟組織的損傷修復(fù)具有重要影響，有望為臨床上尋找減輕腎損傷后組織和細(xì)胞損害的有效干預(yù)手段提供新的理論依據(jù)。

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