劉小琳 康巧梅

（福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院 福建泉州 362332）

引言

硝基苯是制造苯胺的主要原材料，廣泛應(yīng)用于化工、染料和醫(yī)藥工業(yè)，且在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)不會(huì)被替代，而工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中排放的硝基苯對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生很大威脅，被各國(guó)列入優(yōu)先處理的污染物[1,2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界約有1萬(wàn)噸/年的硝基苯排入環(huán)境中[3]，導(dǎo)致環(huán)境承受嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，為了降低硝基苯帶來(lái)的影響，需要采取有效措施降低硝基苯污染帶來(lái)的危害。目前對(duì)硝基苯廢水的處理大多采用吸附、氧化、沉淀及輻照等物理化學(xué)方法，易引起二次污染[4,5]。而相對(duì)于物理化學(xué)方法，微生物降解具有成本低、效率高、不易產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)[6,7]。采用微生物降解方式，可以有效修復(fù)環(huán)境，確保水資源和土壤資源能夠得到循環(huán)利用，提高自然環(huán)境的自凈能力，維持自然環(huán)境可持續(xù)發(fā)展[8]。但由于工業(yè)廢水的污染物濃度和種類有很大差異，培養(yǎng)篩選出對(duì)硝基苯化合物有高效、通用的降解菌群，使之應(yīng)用于廢水處理具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)從三家化工廠排污口的污泥中分離得到以對(duì)硝基苯作為單一碳源[9]的高效降解菌，并對(duì)其降解特性和種屬關(guān)系進(jìn)行研究和探索，為降解工業(yè)廢水中的硝基苯研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

樣本分別取自福建省三家化工廠排污口污泥；大腸桿菌Escherichia coli DH5α由實(shí)驗(yàn)室保存；PMD18-T載體購(gòu)自Takara生物公司。

1.1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl1.00g/L，(NH4)2SO41.00g/L，K2HPO41.50g/L，KH2PO40.50g/L，MgSO40.15g/L，KNO31.00 g/L，pH7.0；富集培養(yǎng)基：在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加50mg/L的硝基苯作為唯一碳源；LB培養(yǎng)基；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、氨芐青霉素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 降解菌的篩選

分別稱取不同地區(qū)排污口污泥2.0g加入50ml無(wú)菌蒸餾水，充分震蕩20min，取5ml上清液，加入100ml的富集培養(yǎng)基中，于28℃，180rpm/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，待培養(yǎng)基渾濁后，取菌懸液 5 ml加入100ml富集培養(yǎng)基培養(yǎng)，重復(fù)轉(zhuǎn)接5次，進(jìn)行稀釋，取100 uL涂布于富集培養(yǎng)基固體平板上，28℃培養(yǎng)3d。挑取單菌落接種于富集培養(yǎng)基中，于28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)1d，檢測(cè)降解效果。

檢測(cè)方法：取 5ml培養(yǎng)液，3000 rpm/min，離心20min，取上清液2 ml，用萘乙二胺偶氮光度法測(cè)定[10]，同時(shí)繪制空白實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 菌種M3形態(tài)學(xué)鑒定

挑取M3單菌落將其接種至2ml富集培養(yǎng)基中，28℃，180rpm/min培養(yǎng)1d，取100ul菌液涂布于富集平板培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)1d，觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 菌種分子鑒定

1.2.3.1 總DNA提取[11]

取菌液1.5ml，置于1.5mlEP管，12000rmp，離心5min。棄上清，收集菌體。晾干，加入500uL的DNA抽提液，旋渦混勻1-2min，在55℃下保溫1h；加入500uL的酚/氯仿（1:1），混勻 3-6min，溶液呈現(xiàn)乳白色，12000rpm，離心 10min，4℃；取上清液，加入 5μL Rnase，37℃，保溫 20-30min；再加入等體積的氯仿；離心取上清，加入1/10的NaAc(3mol/LpH5.2)和2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min以上，離心棄上清；再加入75%的乙醇1ml，懸浮沉淀；離心棄上清，每管中再加入25μL的ddH2O，在-20℃下保存。

1.2.3.2 16s擴(kuò)增

用16s通用引物（上游引物：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，下游引物：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3）進(jìn)行擴(kuò)增。所有PCR反應(yīng)均在50μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中進(jìn)行,其中含有10×PCR緩沖液5 μL，模板DNA、上游引物、下游引物各1μL，dNTP4 μL，Taq 聚合酶 0.5μL，加 ddH2O 至 50ul，于PCR儀上按94℃變性5min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃2 min，重復(fù)以上步驟共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.3.3 PCR產(chǎn)物回收、連接與轉(zhuǎn)化

采用切膠純化法，按柱式DNA膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行?；厥斋@得的DNA產(chǎn)物與PMD18-T vector在16℃下進(jìn)行隔夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞EcoliDH5α進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3.4 菌落PCR驗(yàn)證

挑取轉(zhuǎn)化子接種于含氨芐（100mg/L）5ml培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；用同16S rDNA基因PCR的反應(yīng)體系和條件，用16s上下游引物，進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.3.5 測(cè)序、比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建

上海生工進(jìn)行測(cè)序，并且對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接、比對(duì)和進(jìn)化樹分析。

1.2.4 菌種M3降解特性的研究

將分離純化得到的M3菌種接于100ml添加有50mg/L硝基苯的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別改變溫度、pH值和轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24h后測(cè)定硝基苯的降解率，研究溫度、pH和轉(zhuǎn)速對(duì)硝基苯降解率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌降解能力的測(cè)定

經(jīng)分離純化，在固體平板上得到8株有降解能力的菌種，編號(hào)M1到M8。然后，將8株菌接種于添加有硝基苯的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（硝基苯初始濃度為25mg/l），經(jīng)48h培養(yǎng)后，測(cè)定降解率。結(jié)果見圖1所示，8株菌種均能降解硝基苯，其中M8對(duì)硝基苯的降解率最低，僅為12.53%，M3對(duì)硝基苯的降解率最高，達(dá)56.94%，因此初步認(rèn)定M3為高效降解菌種。

2.2 M3菌落形態(tài)的觀察

菌種M3于28℃，培養(yǎng)24h，其菌落形態(tài)為卵圓形，顏色微黃，表面濕潤(rùn)，如圖2所示。

2.3 M3基因組DNA的提取

菌種M3的基因組提取結(jié)果如圖3所示，DNA條帶位于23.1k左右。

圖2 菌落形態(tài)

圖3 基因組DNA提取

2.4 16SrDNA序列克隆及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

2.4.1 16SrDNA序列克隆

以總DNA為模板，16S通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得16s基因序列，如圖4所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1200bp和1400bp之間。

2.4.2 16SrDNA測(cè)序結(jié)果

由上海生工測(cè)序，獲得16srDNA序列，序列長(zhǎng)度為1331bp，如圖5所示。

圖4 16SrDNA序列克隆

圖5 16SrDNA序列

2.4.3 進(jìn)化樹的構(gòu)建

測(cè)序后將菌株16SrDNA的基因序列與Genebank上的基因序列進(jìn)行相似性分析，由進(jìn)化關(guān)系圖6可知，該菌株屬于假單胞菌屬，與編號(hào)NR043533、GQ254277、KU131279.1的菌株親緣關(guān)系最近。

圖6 進(jìn)化樹分析

2.4.4 菌種M3的降解特性

2.4.4.1 溫度對(duì)M3降解率的影響

如圖7所示，在20℃—40℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，降解率先升后降，在30℃降解率最高。由此可知，M3降解硝基苯的最佳溫度為30℃。

圖7 溫度對(duì)M3降解率的影響

2.4.4.2 pH值對(duì)M3降解率的影響

如圖8所示，隨pH值的升高，M3的降解率呈上升趨勢(shì)，在pH為7的條件下，M3表現(xiàn)出最好的降解效率，隨后降解率呈下降趨勢(shì)。由此可知，M3降解硝基苯的最佳pH為7.0。

圖8 pH對(duì)M3降解率的影響

2.4.4.3 轉(zhuǎn)速對(duì)M3降解率的影響

如圖9所示，隨著轉(zhuǎn)速的提高，M3的降解率逐漸提高，但轉(zhuǎn)速高于150rpm/min時(shí)，降解效率不再顯著增加，趨于穩(wěn)定。由此可知，M3降解硝基苯的最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150rpm/min。

圖9 轉(zhuǎn)速對(duì)M3降解率的影響

結(jié)語(yǔ)

從化工廠污泥中分離得到8株具有降解硝基苯能力的菌種。其中菌種M3降解率最高，降解率為56.94%，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和16SrDNA分析，初步鑒定其為假單胞菌屬。降解特性研究結(jié)果表明，M3在30℃、pH7.0、轉(zhuǎn)速高于150rpm/min的條件下具有高的降解效率。

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