于奇峰，文斌，楊佳利，李廣宇，孫艷彬*

(1.佳木斯大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué) 農(nóng)業(yè)與環(huán)境生物技術(shù)研究所，黑龍江 佳木斯 154007)

狹葉薰衣草(Lavenderangustifolia)是唇形科薰衣草屬多年生草本植物，原產(chǎn)于地中海西部。在醫(yī)藥﹑食品﹑精油制造等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，是重要的化工原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值[1-2]。目前我國栽種的薰衣草主要從國外引進(jìn)，由于土壤、土質(zhì)、氣候等因素影響導(dǎo)致種子萌芽率較低，制約了薰衣草產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，因此薰衣草的品種改良和育種優(yōu)化工作迫在眉睫。因愈傷組織和原生質(zhì)體的細(xì)胞全能性高，是理想的實(shí)驗(yàn)材料[3-5]，在植物品種改良和細(xì)胞生理學(xué)等研究中有廣泛的應(yīng)用[6-7]，故本研究通過探究不同濃度生長調(diào)節(jié)劑對誘導(dǎo)愈傷組織的影響，不同濃度酶液對細(xì)胞壁分解及原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響等方面，為優(yōu)化薰衣草品種，提高東北寒地氣候的適應(yīng)性等后續(xù)育種提供工作基礎(chǔ)。本課題旨在建立薰衣草育種體系，促進(jìn)薰衣草產(chǎn)業(yè)發(fā)展，替代傳統(tǒng)農(nóng)作物種植，以推動?xùn)|北地區(qū)農(nóng)業(yè)模式向現(xiàn)代農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)型。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

MS培養(yǎng)基、吲哚丁酸(IBA)、6-芐基嘌呤(6-BA)、嗎啉乙磺酸(MES)、甘露醇、中性紅染劑、萘乙酸(NAA) 、2, 4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體處理方法

選取薰衣草幼嫩葉片為外植體，用自來水沖洗20min，然后在無菌環(huán)境下對外植體進(jìn)行消毒處理：先用乙醇溶液(75%)進(jìn)行表面消毒1min，無菌水沖洗5次后，用0.1%的升汞溶液滅菌，無菌水沖洗5次。

消毒處理后將外植體分成6組，每組50株外植體，分別給予3、4、5、6、7、8min的滅菌時間，外植體處理完成后移植于含6-BA(0.5mg/L)和NAA(0.1mg/L)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行初代培養(yǎng)，每個組培瓶接種1個薰衣草外植體，18d后統(tǒng)計外植體存活率，確定最佳滅菌時間。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外植體的最佳滅菌時間為升汞處理7min。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

薰衣草外植體經(jīng)處理后將葉片剪切成大小為0.5cm×0.5cm的正方形，接種到含有不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每組處理移植10瓶，每個組培瓶內(nèi)移植5個薰衣草外植體。觀察并記錄薰衣草愈傷組織的誘導(dǎo)情況，于接種25 d后計算薰衣草的出愈率。

1.3 原生質(zhì)體分離

1.3.1 確定薰衣草愈傷組織的滲透壓

配置不同濃度梯度的甘露醇溶液，分組編號后置于試管內(nèi)，將經(jīng)誘導(dǎo)后獲得的薰衣草愈傷組織投入盛有不同濃度的甘露醇溶液的試管內(nèi)，1min后顯微鏡觀察愈傷組織的質(zhì)壁分離情況以確定薰衣草愈傷組織的滲透壓。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適于薰衣草原生質(zhì)體，保持滲透壓平衡的甘露醇濃度為0.6 mol/L。

1.3.2 原生質(zhì)體分離及純化

在無菌環(huán)境下將愈傷組織用無菌的鑷子壓碎至1mm大小，然后將準(zhǔn)備好的試驗(yàn)材料以1∶10的比例放入裝有酶解液的無菌三角瓶中，將三角瓶置于轉(zhuǎn)速為60r/min的25℃恒溫?fù)u床中黑暗震蕩酶解12h以游離原生質(zhì)體。

酶解后獲得的濁液需在無菌環(huán)境下，先經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾去掉渣質(zhì)，然后低速離心機(jī)以800r/min的速度離心8min，棄上清液，下層沉淀為粗提的薰衣草原生質(zhì)體。向粗提的薰衣草原生質(zhì)體中加入CPW洗液(0.1%MES，0.05mol/L CaCl2·2H2O)后，重復(fù)離心3次，原生質(zhì)體培養(yǎng)液(MS液體培養(yǎng)基，0.6mol/L甘露醇)洗滌一次，得到純化后的原生質(zhì)體。

1.3.3 原生質(zhì)體的產(chǎn)量統(tǒng)計與活力測定

使用血球計數(shù)板統(tǒng)計純化后的原生質(zhì)體數(shù)，每組樣品計數(shù)5次，所有數(shù)據(jù)均用SPSS 16.60處理，計算出每克細(xì)胞中原生質(zhì)體數(shù)見公式(1, 2)。

P=N×10×1000

公式(1)

公式(2)

式中：P為每毫升懸浮液中的原生質(zhì)體數(shù)(個/mL)；N為1個大方格內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)(0.1mm2)；Y為原生質(zhì)體的產(chǎn)量(個/g)；V為原生質(zhì)體懸浮液總體積(mL)；M為用于酶解的懸浮細(xì)胞鮮重(g)。

以染色排除法測定原生質(zhì)體的細(xì)胞活力，將中性紅染液與原生質(zhì)體懸浮液混合染色，30s后顯微鏡觀察染色情況，完好且有活力的原生質(zhì)體呈現(xiàn)紅色，每組樣品以血球計數(shù)板統(tǒng)計5次，計算原生質(zhì)體活力，見公式(3)。

公式(3)

式中：H為原生質(zhì)體的活力(%)；L為染成紅色的原生質(zhì)體總數(shù)；T為觀察到的原生質(zhì)體總數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果表明：編號1、2、3、4、5、6、7和8，愈傷組織的出愈率分別為66%、54%、73%、71%、88%、83%、76%和77%，其中編號5的愈傷組織出愈率最高，編號2的愈傷組織出愈率最低。在6-BA的濃度不變的情況下，2,4-D的濃度從1.4mg/L增加至1.8mg/L，愈傷組織的出愈率增大，2,4-D濃度從1.8mg/L增加至2.0mg/L，愈傷組織的出愈率減小，可見生長調(diào)節(jié)劑在濃度較低時，對誘導(dǎo)形成愈傷組織起促進(jìn)作用，生長調(diào)節(jié)劑在濃度較高時，對誘導(dǎo)愈傷組織形成起抑制作用，結(jié)果見表1。

表1 生長調(diào)節(jié)劑各組分濃度及愈傷組織出愈率

2.2 原生質(zhì)體分離

表2 酶液濃度、原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力

原生質(zhì)體分離結(jié)果表明：在果膠酶含量為0.5%的情況下，纖維素酶含量從1.6%增加至2.0%，原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力隨纖維素酶含量的增大而增加；在果膠酶含量為1.0%的情況下，纖維素酶含量從1.6%增加至1.8%，原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力隨纖維素酶含量的增大而增加，但纖維素酶含量從1.8%增加至2.0%時，反而使得原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均有所下降，這一現(xiàn)象表明酶液濃度高時，纖維素酶及果膠酶組成的混合酶液也同樣會將原生質(zhì)體酶解，使其失去細(xì)胞活力，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

本研究中適于薰衣草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+2,4-D 1.8mg/L+6-BA 0.5mg/L，誘導(dǎo)出愈率為88%；適于薰衣草原生質(zhì)體分離的酶液配比：纖維素酶 1.8%+果膠酶 0.5%，原生質(zhì)體產(chǎn)量為1.180×105個，活力為78.05%。本實(shí)驗(yàn)獲得了誘導(dǎo)薰衣草愈傷組織的條件以及建立了原生質(zhì)體分離體系，為后續(xù)獲得適應(yīng)東北寒地氣候的薰衣草品種的育種工作奠定基礎(chǔ)。但本次實(shí)驗(yàn)只探討了不同濃度生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響和不同濃度酶液組合對原生質(zhì)體分離影響，其他因素是否對薰衣草愈傷組織誘導(dǎo)和原生質(zhì)體分離產(chǎn)生影響尚需進(jìn)一步研究。

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