曾娟妮 楊 敏 劉 筱 李文華 周雯婷

1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410005

慢性難愈合創(chuàng)面因虛感邪，邪氣致瘀，經(jīng)久不愈，損其正氣，正虛邪盛，不能托毒外出，瘀阻傷正，正損致腐，最終形成虛、邪、瘀、腐相互作用、互為因果的變化，其中虛是受邪的條件及血瘀傷正的結(jié)果。中醫(yī)學對難愈合創(chuàng)面的認識有著悠久的歷史，數(shù)千年來，歷代醫(yī)家不斷總結(jié)治療經(jīng)驗，積累了煨膿長肉、祛腐生肌、活血化瘀等豐富的治療方法，但是由于中藥復方藥物成分復雜，具有多靶點、多途徑等特點，給研究帶來一定難度，其促愈機制目前探索不明。中醫(yī)藥治療慢性難愈合創(chuàng)面因其療效佳、費用低等特點，深受廣大醫(yī)生及患者歡迎。美洲大蠊提取液，具有通利血脈、散瘀活血、養(yǎng)陰生肌的作用，包含著中醫(yī)扶正驅(qū)邪相輔相成的治療法則，被廣泛應用在創(chuàng)面修復、胃潰瘍、腫瘤等領域[1-2]。筆者前期將美洲大蠊提取物外用于難愈合創(chuàng)面，取得滿意療效[3-4]，同時采用PCR、免疫組化等方法發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取液在肉芽生長期上調(diào)VEGF及TGF表達加速創(chuàng)面愈合，但促愈機制有待于進一步探討。本實驗應用日立 H7700透射電鏡(10000倍),觀察難愈合創(chuàng)面愈合過程中不同時間點傷口基底細胞的超微結(jié)構(gòu)(微絲、橋粒)，進一步驗證美洲大蠊提取液促進慢性難愈合創(chuàng)面修復的作用優(yōu)勢,為臨床推廣應用美洲大蠊提取液防治慢性難愈合創(chuàng)面提供一種可靠的治療方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物 健康成年SPF 級 Wistar 雄性大鼠40只(NO.43004700026384)，12 周齡，體重 220g～250g，適應性喂養(yǎng) 1 周。

1.1.2 藥材 美洲大蠊提取液組所敷紗條用美洲大蠊提取液(康復新，國藥準字Z43020995，湖南中南科倫藥業(yè)有限公司)。貝復濟組所敷紗條用貝復濟(國藥準字S10980075，珠海億勝生物制藥有限公司)。

1.2 方法1.2.1 造模 參照付小兵等[5]全層皮膚缺損法經(jīng)改進制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。將40只大鼠隨機分為：空白組(急性全層皮膚缺損組)10只、對照組(慢性難愈合創(chuàng)面組) 30只?？瞻捉M大鼠根據(jù)模型建立方法在造模區(qū)行全層皮膚切除，但不注射氫化可的松；慢性難愈合創(chuàng)面組大鼠在造模區(qū)行全層皮膚切除后立即注射氫化可的松，制備慢性難愈合創(chuàng)面模型，造模成功后隨機分為模型組10只、美洲大蠊提取液組10只和貝復濟組10只，各組創(chuàng)面制備后即開始藥物干預，并每天換藥1次。

1.2.2 給藥 ①美洲大蠊提取液組：創(chuàng)面外敷兩層美洲大蠊提取液紗條(0.2 mL/cm2)，按創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，再加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。②貝復濟組：創(chuàng)面外敷兩層貝復濟浸透紗布(60U/cm2)，按創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，再加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。③模型組：創(chuàng)面外敷兩層生理鹽水紗布，按創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定。④空白組：備皮處外敷兩層生理鹽水紗布，按備皮面積大小剪成小塊貼于備皮處，加蓋兩層消毒干紗布，膠布固定，不作其他干預。

1.2.3 取材 模型制備完成后，各組于 7 d、15 d共 2個時間點在4組分別隨機取 4只大鼠用 20%烏拉坦 5 mL/kg 腹腔注射麻醉后，取造模區(qū)創(chuàng)面組織，空白組取備皮處的相應部位全層皮膚，深達筋膜層。所取組織樣品在 4℃ PBS 清洗，投入 2.5%電鏡級戊二醛固定液，備透射電鏡觀察。 1.2.4 電鏡觀察 ①取材：組織塊約 1×1×3 mm3。②制片：首先2.5%戊二醛，磷酸緩沖液配制固定 2 h以上。用 0.1M磷酸漂洗液漂洗 3 次，每次 10～15 min，1%鋨酸固定液固定 1～2 h。用 0.1 M磷酸漂洗液漂洗 3 次，每次10～15 min。再脫水：50 %丙酮10～15 min ；70%丙酮 10～15 min；90 %丙酮 10～15 min；100%丙酮 15～20 min，中間更換一次。再浸泡、包埋：純丙酮+包埋液(1∶1)37℃ 12 h；純包埋液 37 ℃ 10～12 h。最后固化：37度烘箱內(nèi)過夜，60 ℃烘箱內(nèi)12～24 h。 超薄切片機切片 50～100 nm。③3 %醋酸鈾以及硝酸鉛雙染色。④日立 H7700透射電鏡觀察、拍片。圖像采集均由中南大學湘雅醫(yī)院電鏡室代為完成。觀察各組傷口愈合處基底細胞的顯微形態(tài)。

1.2.5 橋粒定量分析 角質(zhì)形成細胞之間借助橋粒互相連接，電鏡下可見中央層和附著斑，其上有張力微絲附著，橋粒的主要作用是維持細胞間的連接，能阻止溶液中的分子，特別是大分子沿著細胞間的縫隙滲入體內(nèi)，維持細胞一個穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。美洲大蠊提取物組在難愈合創(chuàng)面上促進傷口愈合優(yōu)勢，研究組特意選取創(chuàng)面細胞中的橋粒作為觀察指標。創(chuàng)面肉芽組織選取第3、7、15天時4組標本各6例。橋粒定量采取10000倍下透射電鏡下觀察計算橋粒面積。

1.3 統(tǒng)計方法 采用統(tǒng)計學軟件 SPSS 18.0 進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)加減標準差表示，兩樣本間比較采用t檢驗，多樣本間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 微絲、橋粒等超微結(jié)構(gòu) 4組標本微絲、橋粒等超微結(jié)構(gòu)，美州大蠊提取液組顯示最佳，貝復濟組次之，空白組更次，模型組最少。如圖1、圖2所示。

2.2 橋粒面積 應用透射電子顯微鏡，對24例標本橋粒面積統(tǒng)計，換藥第3、7、15天時，美洲大蠊提取液組、貝復濟組與空白組橋粒表達水平均明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 透射顯微鏡觀察比較各組不同時期的橋粒面積表達水平 (nm,10000x)

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

3.1 微絲、橋粒結(jié)構(gòu)形態(tài)比較 美洲大蠊提取液組與其他組別比較，微絲密集，緊致，與空白組及模型組有差異；美洲大蠊提取液組創(chuàng)面新生細胞之間存在電子密度稍高的橋粒，與模型組及空白組比較有差異。表明美洲大蠊提取液加速創(chuàng)面新生細胞超微結(jié)構(gòu)的形成，從而維持一個正常穩(wěn)定的細胞內(nèi)環(huán)境。

3.2 橋粒結(jié)構(gòu)量化分析 正常新生細胞之間橋粒連接約20～25 nm，治療第15天時，美洲大蠊提取液作用下的創(chuàng)面細胞間的橋粒面積為(25.7±1.53) nm，連接結(jié)構(gòu)近乎正常細胞間面積，貝復濟組橋粒面積為(23.3±2.06) nm，兩者差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與其他各組間差異性大，且隨著創(chuàng)面愈合時間越長，美洲大蠊提取液組與模型組及空白組之間差異越來越大，進一步表明橋粒的形成成功阻止溶液中大分子沿著細胞間的縫隙滲入體內(nèi)，維持細胞一個穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境從而加速創(chuàng)面愈合。

創(chuàng)面的愈合涉及炎癥反應、白細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞及上皮角質(zhì)細胞等多種細胞的遷移、增殖和分化，細胞生長因子分泌，基質(zhì)沉積等[6-7]，難愈合創(chuàng)面細胞的超微結(jié)構(gòu)是潛在的創(chuàng)面愈合生長標志物，微絲(microfilament)是細胞運動的結(jié)構(gòu)基礎，參與細胞分裂時收縮環(huán)形成，橋粒(bridge granule)多見于上皮，尤以復層扁平上皮細胞間較多，橋粒上有張力微絲附著，張力微絲是角蛋白的前身，它對保持細胞形態(tài)起重要作用，故橋粒對新生細胞的形態(tài)維持起重要作用。實驗結(jié)果提示美洲大蠊提取物對難愈合創(chuàng)面新生細胞的形成有著絕對優(yōu)勢，也進一步證明美洲大蠊提取物通過增加微絲及橋粒的數(shù)量加速細胞分裂，加速肌肉收縮,使微絨毛,應變纖維，胞質(zhì)環(huán)流以及加速細胞間連接，阻止溶液中大分子沿著細胞間的縫隙滲入體內(nèi)，維持細胞一個穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境從而加速創(chuàng)面愈合。

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