吳 翟 王彩榮 張靈敏 楊建新 周 恒 王 麗

1.河北省遷安市中醫(yī)醫(yī)院，河北 遷安 064400；2.河北省遷安市人民醫(yī)院，河北 遷安 064400；3.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050000

金蛭方系課題組經(jīng)過多年篩選出的治療缺血性中風(fēng)的效方，臨床應(yīng)用10余年，但其治療作用機(jī)制尚不十分明確。腦缺血后發(fā)生腦損害的機(jī)制復(fù)雜，炎性反應(yīng)是缺血性腦損害的主要機(jī)制之一[1]。在參與炎癥反應(yīng)的眾多因子中，最有影響的是IL-lβ和TNF-α[2]。但中藥對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠IL-1β、TNF-α水平變化影響的報(bào)道相對(duì)較少。研究旨在通過觀察金蛭方對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠血清及腦組織IL-1β、TNF-α表達(dá)的影響，探討其治療缺血性中風(fēng)的部分作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只，清潔級(jí)，體重250～300 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：1119069。

1.2 藥物與試劑 金蛭方組成：水蛭、郁金、川芎、冰片(由遷安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備)，上4味除冰片外水提濃縮成高、低劑量后加入相應(yīng)研磨冰片，所含生藥分別為：0.30 g/mL(高劑量)、0.15 g/mL(低劑量)。尼莫地平片(國藥準(zhǔn)字：H41022175，規(guī)格：20 mg/片，鄭州瑞康制藥有限公司)，按體重0.001 g/mL配制成水溶液。IL-1β放射免疫分析試劑盒、TNF-α放射免疫分析試劑盒均由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所提供。

1.3 儀器 FJ-2020型γ射線免疫計(jì)數(shù)器(國營(yíng)262廠)；MSE-25型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；LAUDA-C3型循環(huán)恒溫水浴箱(泰克儀器有限公司)；F6/10型超細(xì)勻漿機(jī)(上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司) 。

1.4 造模方法 參考改良的Longa法[3]：頸部正中切口，用3-0手術(shù)絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈(ECA)遠(yuǎn)端及枕動(dòng)脈，在結(jié)扎線距分叉部2 mm處剪斷ECA，將一端已加工成光滑球形的尼龍線從ECA殘端插入進(jìn)行結(jié)扎，將尼龍線經(jīng)頸總動(dòng)脈(CCA)分叉部插入頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，此時(shí)松開CCA，ICA套線恢復(fù)血流，線栓推送順滑，無出血。將線栓向上深入至分叉以上18～19 mm達(dá)到大腦中動(dòng)脈開口處，將頸總動(dòng)脈連同尼龍線一起結(jié)扎，縫合切口后外留尼龍線0.5cm，放到單籠中，2h后外拉尼龍線使其球端回至ECA進(jìn)行缺血后再灌注。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與給藥[4]60只大鼠自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)于18～22℃明暗各12 h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組。假手術(shù)組：手術(shù)時(shí)僅作頸部手術(shù)切口，鈍性分離頸前肌，游離暴露頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，術(shù)后當(dāng)日灌服蒸餾水。模型對(duì)照組(簡(jiǎn)稱模型組)：造模當(dāng)日灌服蒸餾水。金蛭方低劑量組(簡(jiǎn)稱低劑量組)：造模當(dāng)日灌服金蛭方，每日用藥劑量為1.5 g/kg(相當(dāng)于成人劑量的10倍)。金蛭方高劑量組(簡(jiǎn)稱高劑量組)：術(shù)后當(dāng)日灌服金蛭方，每日用藥劑量為3.0 g/kg (相當(dāng)于成人劑量的20倍)。陽性藥尼莫地平片對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)：術(shù)后當(dāng)日灌服尼莫地平片，每日用藥劑量為0.01 g/kg (相當(dāng)于成人劑量的20倍)。各組1次/d灌胃，每次用藥體積均按1 mL/100 g計(jì)算，連續(xù)給藥2周。

1.6 檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)2周末，最后1次給藥禁食12h后，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，注入離心管中待凝固后，4℃ 3000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。取血后，迅速斷頭冰浴中取右側(cè)大腦額葉皮層同一位置取腦組織100 g，濾紙吸干血跡，盡快加入預(yù)冷的生理鹽水碾磨，制成組織勻漿，4℃3000 r/min離心，15 min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。放免法檢測(cè)血清及腦組織中TNF- α、IL-1β的含量，具體操作嚴(yán)格遵照試劑盒說明書。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清及腦組織勻漿IL-1β、TNF-α表達(dá)顯著升高；經(jīng)用藥干預(yù)后，各治療組均能降低大鼠血清及腦組織勻漿IL-1β、TNF-α表達(dá) (P<0.01)；其中，高劑量組較低劑量組和對(duì)照組大鼠血清及腦組織勻漿IL-1β、TNF-α表達(dá)降低(P<0.05)，低劑量與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別鼠數(shù) IL-1β TNF-α 血清腦組織勻漿血清腦組織勻漿假手術(shù)組1241.324±4.02868.472±5.9910.746±0.0610.384±0.086模型組1195.921±8.014*128.230±28.224*1.497±0.229*0.775±0.201*高劑量組1057.543±4.049*#80.151±22.975*#0.807±0.214*#0.466±0.104*#低劑量組1169.482±6.089*#Δ91.568±26.641*#Δ1.014±0.227*#Δ0.571±0.117*#Δ對(duì)照組1267.387±5.473*#Δ89.996±26.049*#Δ1.008±0.225*#Δ0.567±0.099*#Δ

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；與高劑量組比較，ΔP<0.05。

3 討論

課題組通過對(duì)中風(fēng)病臨床癥候?qū)W研究，認(rèn)為缺血性中風(fēng)患者多是在氣血內(nèi)虛的基礎(chǔ)上，加之勞倦內(nèi)傷、憂思惱怒、嗜食厚味、煙酒等誘因，導(dǎo)致氣血逆亂，直沖犯腦，致氣血瘀滯，腦脈痹阻。氣滯、血瘀、絡(luò)阻為本病的主要病機(jī)，“氣行則血行”，行氣、活血、通絡(luò)為其有效治則組成金蛭方，研制院內(nèi)制劑“金蛭膠囊”(制劑號(hào)：冀藥制字Z20051013)，治療缺血性中風(fēng)10余年，療效滿意。方中水蛭破血逐瘀、通經(jīng)活絡(luò)，《本草匯言》曰：“水蛭逐惡血、散瘀血之要藥也”；郁金行氣活血，化痰降火，《本草匯言》曰：郁金其性清揚(yáng)，能散郁滯，順逆氣，上達(dá)高巔，善行下焦；川芎行氣活血，歷代醫(yī)家認(rèn)為其：“善治中風(fēng)，治風(fēng)圣藥”[5]；冰片醒神通竅，《本草衍義》曰：“芳香走竄，引藥上行，獨(dú)行則勢(shì)弱，佐使則有功”，四藥合用，共奏活血、化瘀、通絡(luò)之功。

IL-lβ是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)細(xì)胞因子之一，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)的不同而有2種類型：IL-Iα和IL-1β，兩者的基因結(jié)構(gòu)上有20%～30%的同源性，在許多系統(tǒng)中作用相似，但在腦內(nèi)以IL-lβ的作用為主。IL-1β在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和腦對(duì)各種損傷的反應(yīng)中有重要的作用[6]。IL-1β的生物學(xué)作用包括刺激其它細(xì)胞因子和可溶性損傷介質(zhì)的合成、誘導(dǎo)白細(xì)胞浸潤(rùn)、影響膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)等。研究表明，IL-1β可能參與缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元死亡，在缺血性病理損傷中起重要作用[7]。

Carswell等在給接種過卡介苗的小鼠注射脂多糖(LPs)后發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中出現(xiàn)一種能引起腫瘤出血性壞死的物質(zhì)，并將其命名為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)。TNF分為TNF-a和TNF-β。TNF-a為一種細(xì)胞分泌的蛋白，屬于一種前炎癥細(xì)胞因子[8]，在觸發(fā)炎癥反應(yīng)中處于中心地位，與IL-1、IL-6和生長(zhǎng)因子共同啟動(dòng)，調(diào)節(jié)大腦局部炎癥反應(yīng)[9]。

研究表明，采用線栓法復(fù)制的缺血性中風(fēng)大鼠模型血清及腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α表達(dá)升高，說明IL-1β和TNF-α參與了缺血性中風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展。經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組可降低大鼠血清及腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α表達(dá)，表明金蛭方能調(diào)節(jié)IL-1β和TNF-α分泌和釋放，以達(dá)到減輕腦缺血炎癥、改善神經(jīng)功能、預(yù)防和治療缺血性中風(fēng)的作用，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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