栗 園 楊 斌 闞永軍 胡 娟. 龐文生*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺的功效[1]，其多糖有顯著的降血糖作用，且能降低血脂水平，改善脂質(zhì)代謝紊亂[2]。課題組前期利用水提醇沉法得到太子參粗多糖，采用DEAE-纖維素、葡聚糖凝膠色譜柱對太子參粗多糖進(jìn)行分離純化得到均一多糖[3-6]。為了進(jìn)一步考察均一多糖的活性，建立靈敏、特異性強(qiáng)的檢測方法，是監(jiān)測均一多糖細(xì)胞體外/動物體內(nèi)吸收、代謝特征的關(guān)鍵。

目前檢測多糖的方法有分光光度法、柱前衍生-高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、電化學(xué)法。傳統(tǒng)苯酚硫酸分光光度檢測法粗糙、靈敏度低；酶分析法或電化學(xué)法雖然檢測靈敏度高，但受到特異性及樣品中污染物干擾的限制；色譜法能夠準(zhǔn)確、靈敏地對多糖進(jìn)行定性定量的分析，因此在多糖的分析中占有非常重要的地位；而柱前衍生-高效液相色譜法，是將樣品水解后測定單糖組成，無法考察多糖分子的整體行為[7-8]。

對糖類物質(zhì)而言，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中不含生色團(tuán)，不產(chǎn)生紫外光吸收；多數(shù)不產(chǎn)生熒光，無法實(shí)現(xiàn)直接進(jìn)行紫外或熒光檢測。因此，筆者對太子參均一多糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，建立一種太子參熒光均一多糖的HPLC-FLD檢測方法，以期為太子參多糖在細(xì)胞或體內(nèi)吸收和活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 MOKULYOD-230型冷凍干燥器；3001多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher 公司)；HL-2D定時數(shù)顯恒流泵；DBS-100自動部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；AE240S分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Waters e2695液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測器(Waters 公司)；HiTrapTM Desalying分離柱(5 mL，5×5 mL)；Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 Lμm)色譜柱。1.2 材料 太子參樣品于2016年7月購于福建柘參種業(yè)有限公司，經(jīng)福建省中醫(yī)藥研究院闞永軍實(shí)習(xí)研究員鑒定為石竹科孩兒參的干燥塊根；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品購于福州天美化工儀器設(shè)備有限公司(Pharmacia17-0320-01)；異硫氰酸熒光素(FITC,批號：SLBH5922V，Sigma 公司)；Celluose DE-52(批號：1030A024，Whatman 公司)；Sephacryl S-300HR(批號：20140117，GE 公司)；氰基硼氫化鈉(批號：1605027，aladdin 公司)；甲醇(批號：20080418)、DMSO(批號：20130711)、乙酸(批號：20160425)、硝酸鈉(批號：20151225)等購自國藥化工；無水乙醇(批號：16010902，西隴化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 太子參均一多糖的熒光標(biāo)記 取一定量太子參均一多糖，溶于DMSO，依次加入100μL氰基硼氫化鈉溶液，100μL酪胺溶液，50μL冰醋酸，補(bǔ)充DMSO到2 mL，多糖∶氰基硼氫化鈉∶酪胺的質(zhì)量比為2∶1∶2，60℃反應(yīng)4h；離心，上清液過HiTrapTM Desalying柱，用水洗脫，酶標(biāo)儀280nm檢測，收集第一個峰，凍干得多糖-Tyr。

取一定量的多糖-Tyr，加入pH=8.5的0.5 mol/L NaHCO31.5 mL，加入過量FITC，避光反應(yīng)過夜；反應(yīng)物中加入無水乙醇至終濃度為80%，離心，沉淀加水復(fù)溶，乙醇再沉淀，重復(fù)3次，得多糖-Tyr-FITC；HiTrapTM Desalying柱純化，酶標(biāo)儀490～518 nm檢測，收集第一個峰，凍干即得。

2.2 熒光多糖的HPLC-FLD檢測條件考察2.2.1 檢測波長的確立 準(zhǔn)確稱取一定量的FITC，用30%乙腈溶解，酶標(biāo)儀分別固定激發(fā)波長和發(fā)射波長來確立最佳檢測波長，結(jié)果見表1。當(dāng)固定激發(fā)波長時，發(fā)射波長在518 nm時有最大吸光度；固定發(fā)射波長時，激發(fā)波長在490 nm時有最大吸光度。因此，確立熒光檢測激發(fā)波長(λx)為490 nm、發(fā)射波長(λm)為518 nm。

表1 最佳檢測波長選擇結(jié)果

2.2.2 樣品溶劑的選擇 采用不同溶劑溶解FITC，相同色譜條件下分析，結(jié)果如圖1所示。采用水、0.01 mol/L磷酸二氫鉀、25%甲醇作為溶劑，均不能檢出FITC色譜峰；以30%乙腈作為溶劑，F(xiàn)ITC可得單一對稱峰。因此確定30%乙腈作為樣品溶劑。

2.2.3 流動相的選擇 分別為甲醇-水(25∶75)、甲醇-氨水(60∶40)、乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鉀(30∶70)作為流動相，其余色譜條件相同下檢測，結(jié)果如圖2所示。以甲醇-水(25∶75)、甲醇-氨水(60∶40)為流動相時，F(xiàn)ITC均不能被檢出；以乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鉀(30∶70)為流動相時，F(xiàn)ITC可得單一對稱峰。因此，確定乙腈-0.01mol/L磷酸二氫鉀(30∶70)為流動相。

2.2.4 色譜柱的選擇 以色譜柱為考察因素，考察Waters Ultrahydrogel TM 500 (7.8×300 mm)、大連依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，在相同色譜條件下分析，結(jié)果如圖3所示。用Waters Ultrahydrogel TM 500(7.8×300mm)色譜柱時，F(xiàn)ITC不能出峰；用大連依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱時，F(xiàn)ITC可得單一對稱峰。因此，確定大連依利特Hypersil BDS C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)為本實(shí)驗(yàn)的色譜柱。

綜上，本研究所建立方法的最佳色譜條件為：Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀(30∶70)流動相；流速0.5 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為518 nm；樣品溶劑為30%的乙腈。

2.3 熒光均一多糖的HPLC-FLD檢測2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取分子量為40000 Da熒光葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品0.25、0.5、1、2、4 mg，30%的乙腈定容至10 mL，得濃度為25、50、100、200、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.4項(xiàng)”下的色譜條件檢測，以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(伏·秒)為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程Y=0.073x+ 0.310，相關(guān)系數(shù)r=0.9989。

2.3.2 樣品分析 準(zhǔn)確稱取300 μg太子參熒光均一多糖，30%的乙腈定容至1 mL，濃度為300 μg/mL，以同樣的方法配制FITC溶液，按“2.2.4項(xiàng)”下的色譜條件檢測。結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果表明，在該條件下未標(biāo)記均一多糖未檢測到色譜峰，F(xiàn)ITC色譜峰保留時間為36.58 min，熒光均一多糖保留時間為4.25 min，峰面積為13.75伏·秒，代入回歸方程，得出太子參熒光均一多糖以熒光葡聚糖(分子量40000 Da)計(jì)濃度為184.1 μg/mL。

3 討論

3.1 溶液選擇 對太子參熒光均一多糖的HPLC-FLD的檢測條件考察過程中，發(fā)現(xiàn)熒光多糖在有乙腈存在的體系中容易被檢測到，因此樣品溶劑和流動相中都含有乙腈；多糖在乙腈中的溶解度與分子量成反比，所以本實(shí)驗(yàn)樣品溶劑和流動相中均含有30%的乙腈。

3.2 對照品選擇 本實(shí)驗(yàn)所用太子參熒光均一多糖的分子量在50000 Da左右，由于沒有太子參熒光多糖的對照品，因此選擇結(jié)構(gòu)相似、分子量相近40000Da的熒光葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品作為對照品，所以本實(shí)驗(yàn)是以熒光葡聚糖表示太子參熒光均一多糖的測定結(jié)果。

3.3 檢測方法建立 對糖類物質(zhì)而言，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中不含生色團(tuán)，不產(chǎn)生紫外光吸收；多數(shù)不產(chǎn)生熒光，無法實(shí)現(xiàn)直接紫外或熒光檢測。本文采用FITC對太子參均一多糖進(jìn)行熒光標(biāo)記后，實(shí)現(xiàn)高效液相色譜熒光檢測器檢測；所建立的檢測方法檢測限低、受雜質(zhì)干擾較小，可為今后研究太子參多糖在體內(nèi)外的吸收特征、藥效分子機(jī)制等提供技術(shù)支撐。

綜上，筆者將一種太子參均一多糖成功地進(jìn)行了熒光標(biāo)記。以490 nm為激發(fā)波長、發(fā)射波長518 nm，大連依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm/5 μm)色譜柱，30%的乙腈為樣品溶劑，乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀(30∶70)為流動相，建立太子參熒光均一多糖的HPLC-FLD檢測方法。該方法準(zhǔn)確、有效，可為太子參多糖在體內(nèi)外吸收特征和活性研究奠定基礎(chǔ)。

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