李蕾

摘 要：目的：通過(guò)研究云南獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)、小苗增殖和生根的適宜培養(yǎng)基，建立一套獨(dú)蒜蘭組織培養(yǎng)的快速繁殖體系。方法：以獨(dú)蒜蘭種子為外植體，研究激素（6-benzylaminopurine和1-naphthlcetic acid） 不同質(zhì)量濃度配比對(duì)云南獨(dú)蒜蘭小苗增殖和壯苗生根的影響。結(jié)果：云南獨(dú)蒜蘭小苗增殖最適培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L，壯苗與生根最適培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L。結(jié)論：建立了一套云南獨(dú)蒜蘭組培快繁體系，可用于大規(guī)模生產(chǎn)云南獨(dú)蒜蘭組培苗。

關(guān)鍵詞：云南獨(dú)蒜蘭；種子；組培快繁

中圖分類(lèi)號(hào) S63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）01-0010-03

Abstract：Objective To explore suitable culture mediums for the seed germination，seedling multiplication，rooting and growth of plantlet in Pleione yunnanensis，in order to establish a tissue culture and rapid propagation system.Methods Seeds of Pleione yunnanens is were used as the explants，and the effects of different mediums on proliferation，rooting and seedling. Results The most suitable culture medium for proliferation was 1/2MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L，The most suitable culture medium for rooting and seedling was 1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L。Conclusion This research established a tissue culture and rapid propagation system，which could be used for the large scale production of Pleione yunnanensis.

Key words：Pleione yunnanensis；Seed；Tissue culture and rapid propagation

云南獨(dú)蒜蘭〔Pleione yunnanensis（Rolfe）Rolfe〕，蘭科獨(dú)蒜蘭屬的一種半附生蘭，國(guó)內(nèi)主要產(chǎn)于四川、貴州和云南[1]，假鱗莖為中藥山慈菇的主要來(lái)源之一。云南獨(dú)蒜蘭為《中國(guó)藥典》收載品種，具有清熱解毒、止咳化痰，止血生肌。主治肺結(jié)核，百日咳，氣管炎，癰腫，消化道出血，外傷出血等[2]。近年來(lái)，由于其含有的秋水仙堿具有抗腫瘤的活性，獨(dú)蒜蘭市場(chǎng)需求量不斷增加。但其種子小，自然狀態(tài)下很難成功萌發(fā)及生長(zhǎng)，加之野生資源破壞嚴(yán)重，所以通過(guò)組織培養(yǎng)是獲得大量完整再生植株的重要技術(shù)手段，亦是緩解資源環(huán)境壓力的主要途徑。近年來(lái)有少量關(guān)于獨(dú)蒜蘭組織培養(yǎng)方面的報(bào)道，如陳之林等人對(duì)白花獨(dú)蒜蘭進(jìn)行了組培快繁研究，以種子和原球莖為外植體成功獲得了組培苗[3]；張燕等人認(rèn)為，在獨(dú)蒜蘭組培快繁研究中，以種子為外植體生產(chǎn)組培苗是最好的方法[4]。本文就云南獨(dú)蒜蘭組培快繁體系進(jìn)行了研究，為建立和完善云南獨(dú)蒜蘭的人工繁育技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 外植體：以云南獨(dú)蒜蘭成熟且未開(kāi)裂的蒴果為外植體，采自云南省文山市。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 用適量洗潔劑先洗滌蒴果6min，然后用無(wú)菌水沖凈洗潔精，在超凈工作臺(tái)上將洗滌后的蒴果用75%的酒精表面消毒處理2min，再用0.1%的升汞（HgCl2）消毒15min，用無(wú)菌水沖洗6次，用無(wú)菌濾紙吸干蒴果表面的水分。

1.2.2 無(wú)菌播種 超凈工作臺(tái)上用消毒后的手術(shù)刀將消毒處理過(guò)的蒴果兩端切除，縱向剖開(kāi)蒴果，將種子播于培養(yǎng)基上，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使種子均勻散布。完成接種后將其置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，誘導(dǎo)種子萌發(fā)階段避光培養(yǎng)，溫度為25℃，待種子萌發(fā)出原始球莖后采用光照培養(yǎng)，溫度為25℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1200lx。此階段培養(yǎng)基為：1/2MS+NAA（1.0mg/L）+炭粉（1g/L）+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L），pH=5.8。

1.2.3 原球莖增殖 在播種40d后極少數(shù)原球莖開(kāi)始分化出葉，同時(shí)原球莖繼續(xù)增殖，形成苗和原球莖混雜的塊狀物。此時(shí)的原球莖經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)，有利于原球莖的增殖，生長(zhǎng)速度加快。本階段采用光照培養(yǎng)，溫度25℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1200lx。此階段以1/2MS+6-BA（1.5mg/L）+NAA（0.5mg/L）+炭粉（1g/L）+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L），pH=5.8為原球莖繼代培養(yǎng)、增殖的培養(yǎng)基。

1.2.4 葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖 原球莖經(jīng)增殖培養(yǎng)20d后大部分原球莖都能長(zhǎng)出第1片葉芽，但叢生芽數(shù)量相對(duì)較少，葉片弱小，此時(shí)，需對(duì)繼代增殖原球莖進(jìn)行葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖，選用已經(jīng)設(shè)計(jì)好的不同激素種類(lèi)和濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選擇大小適合的原球莖用于接種。采用光照培養(yǎng)，溫度為25℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1200lx。經(jīng)培養(yǎng)40d后，統(tǒng)計(jì)叢生芽的數(shù)目。此階段以1/2MS+6-BA（變量）+NAA（變量）+炭粉（1g/L）+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L），pH=5.8為原球莖繼代培養(yǎng)、增殖的培養(yǎng)基。

1.2.5 生根壯苗培養(yǎng) 選取經(jīng)葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖的小苗用于生根壯苗培養(yǎng)研究，設(shè)計(jì)不同激素種類(lèi)和濃度進(jìn)行培養(yǎng)，所選材料要求大小和長(zhǎng)度，生長(zhǎng)狀況一致的小苗。完成接種后將材料移至培養(yǎng)室中，采用光照培養(yǎng)，溫度為25℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1200lx。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)種子無(wú)菌萌發(fā)階段 種子在播于培養(yǎng)基后約24d開(kāi)始萌發(fā)，出現(xiàn)白色類(lèi)原球莖，然后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)，白色原球莖逐漸形成黃綠色的原球莖，出現(xiàn)綠色點(diǎn)芽點(diǎn)。原球莖逐漸長(zhǎng)大，顏色轉(zhuǎn)綠，在播種40d后極少數(shù)開(kāi)始分化出葉，同時(shí)原球莖繼續(xù)增殖，形成苗和原球莖混雜的塊狀物。

2.2 葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖階段 此階段設(shè)計(jì)不同激素種類(lèi)和濃度進(jìn)行培養(yǎng)。原球莖經(jīng)過(guò)葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖培養(yǎng)30d后，叢芽數(shù)目開(kāi)始增多，多數(shù)芽也長(zhǎng)成接種前1～4cm不等的小苗，而且基部開(kāi)始膨大，直徑大多達(dá)1～2mm。此時(shí)進(jìn)行觀察和測(cè)量，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)葉芽數(shù)目如表1。

對(duì)原球莖進(jìn)行芽誘導(dǎo)是組培中的重要環(huán)節(jié)，提高葉芽誘導(dǎo)率和叢芽增殖，為獲得大量的組培苗奠定基礎(chǔ)。為能反應(yīng)出各處理對(duì)獨(dú)蒜蘭原球莖的葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖影響作用的差異，從中選取到最佳激素組合，所以對(duì)表1結(jié)果進(jìn)一步作方差分析，見(jiàn)表2。

表2中可以看出，NAA的P=0.019<0.05，6-BA的P=0.177>0.05，表明：在該范圍濃度下的NAA和6-BA組合對(duì)處理對(duì)獨(dú)蒜蘭原球莖的葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖影響作用實(shí)驗(yàn)中，對(duì)葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖影響的主效應(yīng)是NAA，而6-BA的影響不顯著。在6號(hào)處理組NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L中的平均出芽數(shù)最多，葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖效果最好。

2.3 生根壯苗培養(yǎng)階段 此階段設(shè)計(jì)不同激素種類(lèi)和濃度進(jìn)行培養(yǎng)。50d觀察不同處理組，葉片較接種前增長(zhǎng)，莖的基部膨大明顯，膨大的基部下面長(zhǎng)出1～4條根。此時(shí)進(jìn)行觀察和測(cè)量，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)目、根長(zhǎng)，球莖大小及葉片長(zhǎng)度，見(jiàn)表3。

在組培中，生根率是重要的指標(biāo)，為能反應(yīng)出各處理對(duì)云南獨(dú)蒜蘭組培苗生根情況影響作用的差異，從中選取到最佳激素組合，所以對(duì)表3結(jié)果進(jìn)一步作方差分析，見(jiàn)表4。

表中4可以看出，NAA的P=0.002<0.05，6-BA的P=0.007<0.05，表明：在該范圍濃度下的NAA和6-BA組合對(duì)處理對(duì)云南獨(dú)蒜蘭組培苗生根率影響作用實(shí)驗(yàn)中，不同濃度NAA和6-BA組合對(duì)組培苗的生根率影響均達(dá)到了顯著水平。在9號(hào)處理組NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L的平均生根率最高，平均根長(zhǎng)度也最長(zhǎng)，生根效果相對(duì)較好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選取云南獨(dú)蒜蘭經(jīng)授粉、成熟且未開(kāi)裂的蒴果內(nèi)的種子為外植體，誘導(dǎo)種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖。在此基礎(chǔ)上，對(duì)原球莖進(jìn)行增殖、擴(kuò)繁，獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所需的愈傷組織和不定芽。叢生芽誘導(dǎo)階段，以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，處理組（1/2 MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L）的平均出芽數(shù)最多，對(duì)葉芽誘導(dǎo)、叢芽增殖效果最好。生根壯苗階段，以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，處理組（1/2 MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.3mg/L）的平均生根率最高，平均根長(zhǎng)度也最長(zhǎng)，生根效果最好。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：施婷婷）endprint