卓麗丹,馮頂麗,蘆 笛,李 紅,傅 營 綜述 郭紅延 審校

因手術(shù)、創(chuàng)傷、牙周疾病導(dǎo)致骨缺損和骨缺失的修復(fù)問題一直備受人們關(guān)注。臨床骨修復(fù)及再生傳統(tǒng)方法主要有，自體骨移植、異體骨移植、引導(dǎo)組織再生和牽張成骨術(shù)。這些方法存在操作復(fù)雜、損傷大、修復(fù)時間長等局限性，近年來，骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)為骨修復(fù)或者骨再生提供了新的治療策略。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層，屬于多能干細胞。MSC具有成骨分化潛能，提取技術(shù)簡便、來源廣泛等優(yōu)點，常用于工程化骨組織的構(gòu)建。目前促進干細胞骨分化的方法有: 肽類、表型遺傳、小分子化合物、Micro RNA和物理誘導(dǎo)等。越來越多的證據(jù)表明MicroRNA參與干細胞骨分化過程轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控，本文主要以Micro RNA對MSC骨分化的研究進展進行闡述。

1 MSC發(fā)現(xiàn)及作用

1966年，F(xiàn)riedenstein等[1]首先發(fā)現(xiàn)骨髓中存在具有分化為成骨細胞的干細胞;至1991年Caplan[2]進一步將這類干細胞統(tǒng)稱為“間充質(zhì)干細胞”；1999年，Pittenger等[3]在science上發(fā)表，MSC具有多向分化的潛能，激起眾多研究者對于MSC多向分化潛能的研究[4]。因MSC具有成骨分化潛能，來源廣，易提取，目前已成為骨組織工程中理想的種子細胞[5]。

干細胞骨分化涉及多個信號通路、轉(zhuǎn)錄因子、化學(xué)小分子等之間的相互復(fù)雜而又穩(wěn)定的作用。研究者對MSC成骨分化進行大量的研究[6]，BMP、TGF、wnt/β-catenin、Notch、RUNX2、osterix、骨形成蛋白、地塞米松(dexamethasone)、β-甘油磷酸酯等對MSC骨向分化有重要的作用。近年來一些實驗結(jié)果顯示出Micro RNA (miRNA)在調(diào)節(jié)骨分化過程中起著關(guān)鍵的作用。

2 Micro RNA 的概述

miRNA是一種潛在的調(diào)節(jié)成骨分化的內(nèi)源性小RNA分子，一般長度為21～25 bp，主要作用于mRNA的3’端非編碼序列區(qū)，促進或者阻遏翻譯作用。與骨方向分化的調(diào)控方式和通路有密切關(guān)系。單一miRNA可能作用于不同的信號傳導(dǎo)通路或者轉(zhuǎn)錄因子，同時信號傳導(dǎo)通路或者轉(zhuǎn)錄因子也可由不同的miRNA協(xié)調(diào)控制。因效率高，價格低，對于人體無損害，故成為目前干細胞骨分化研究熱點，不同的miRNA對于MSC骨向分化扮演者不同的角色，本文對miRNA在MSC成骨分化中的作用進行如下進行闡述。

2.1 miRNA促進MSC骨向分化的機制 不同的miRNA作用靶點不同，其作用機制也各有差異。下面詳細介紹一些miRNA促進MSC成骨分化的作用靶點及信號通路。

2.1.1 BMP信號傳導(dǎo)通路 骨形成蛋白家族(BMP)對于干細胞骨向分化具有促進作用，是經(jīng)典傳導(dǎo)通路之一。BMP2、BMP4、BMP7可通過細胞膜上的跨膜受體,磷酸化smad1/5/7與smad4形成共價物進入細胞核內(nèi)促進干細胞骨向分化[7]。2009年Kim等[8]在實驗中使用慢病毒轉(zhuǎn)載miR-196a在ADSC中過表達，發(fā)現(xiàn)降低了ADSC的增殖，但對于ADSC骨向分化具有促進作用，對脂向分化無任何影響。實驗發(fā)現(xiàn)miR-196a通過靶向作用于HOXC8 3’UTR抑制HOXC8的蛋白和轉(zhuǎn)錄水平。HOXC8降低堿性磷酸酶(ALP)活性，對于骨分化具有抑制作用。2014年廖雅馨等[9]利用桿狀病毒介導(dǎo)BMP2+miR-148b的共表達植入小鼠頭蓋骨4 mm缺損，發(fā)現(xiàn)BMP2+miR-148 b具有協(xié)同作用，促進骨缺損愈合，修復(fù)骨面積、骨量、骨密度分別為 (94.7±0.8)%，(89.4 ±11.1)%和(95.7±3.9)%。

2.1.2 TGF-β信號傳導(dǎo)通路 TGF超家族廣泛參與細胞的增殖、分化和胚胎的發(fā)育。主要分為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3其中BMP信號通路屬于TGF-β1家族。2012年研究發(fā)現(xiàn)，hADMSC中過表達miR-22、過表達陰性對照、以及不作處理對照組，發(fā)現(xiàn)miR-22促進骨分化。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-22作用于TGF-β信號通路，通過抑制成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2)的抑制劑HDAC6促進骨分化[10]。成骨早期階段，MIR-29b通過靶向調(diào)節(jié)WNT/smad/TGF-β信號通路抑制劑HDAC4，TGFbeta3，ACVR2A，CTNNBIP1和DUSP2，晚期成骨階段，參與控制分化成骨細胞中的膠原合成，并且使用PCR定量分析成骨標志物，成骨標志物的水平隨著miR-29b濃度的增加而增加[11]。

2.1.3 GSK信號傳導(dǎo)通路 GSK-3是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶，GSK信號通路是將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，從而引起細胞反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。系統(tǒng)主要有GSK-3α和GSK-3β兩種亞型。采用人BMSC過表達miR-346，其作用靶點GSK-3β，耗盡GSK-3β促進骨分化，而過表達GSK-3β發(fā)現(xiàn)miR-346表達降低并且對于骨分化具有抑制作用。同時還發(fā)現(xiàn)miR-346對于WNT/βcatenin具有激活作用，促進骨分化[12]。2015年，Meng等[13]使用志愿者的MSC作為研究對象， 分別進行陰性對照、miR-21過表達、MiRNA-21基因沉默分組研究發(fā)現(xiàn)。miR-21過表達GSK-3β磷酸化，72 h后相對于陰性對照組，βcatenin表達增加，并且RUNX2蛋白表達量增加3倍。

2.1.4 Notch信號通路 是一種復(fù)雜的信號通路，具有雙向作用，在脂肪分化過程中Notch顯示出通過抑制WNT/βcatenin抑制骨向分化[13，14]。同時也有研究表明Notch信號通路具有促進骨分化的作用。Notch信號通路其受體與配體在骨分化中起重要作用，抑制Notch1活性能抑制BMP9誘導(dǎo)的MSC增殖和成骨分化中；DLL1增加BMP9誘導(dǎo)的MSC增殖和成骨分化，Jagged1能增加BMP9誘導(dǎo)的MSC增殖和體外成骨分化[15]。通過jag1的處理激活Notch信號通路，檢測出miR-34a表達增加。隨后研究發(fā)現(xiàn)，在根尖乳頭干細胞(SCAP)中轉(zhuǎn)染過表達miR-34a，導(dǎo)致NOTCH2, N2ICD, and HES1蛋白表達降低，但RUNX2, 鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子OSX, 骨鈣素(OCN)和骨橋蛋白(OPN)蛋白水平上升，促進骨分化,轉(zhuǎn)染2周后，SCAP的礦化導(dǎo)致miR-34a下調(diào)；SCAP 轉(zhuǎn)染表達anti-miR-34a, NOTCH2, N2ICD, and HES1蛋白表達升高，然而RUNX2, OSX, OCN, 和OPN蛋白水平水平降低[16]。

2.2 miRNA直接作用于骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子 某些miRNA直接作用于特異性轉(zhuǎn)錄因子，RUNX2又稱為核心結(jié)合因子，是骨分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，促進OCN、ALP和Ⅰ型膠原等成骨基因的表達，在骨分化的過程中RUNX2處于核心地位(表1)。

miR-9具有促進骨分化的作用，觀察miR-9與RUNX2之間的相互關(guān)系。羅紅等[17]取人的骨髓MSC(hBMSC)在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)觀察miR-9的表達情況，以及過表達miR-9和正常組對照表明，miR-9促進RUNX2的表達，促進骨分化。 miR-22在成骨分化過程中表達升高，在成脂分化過程中降低。MiR-22作用機制為：miR-22與HDAC6的3’端UTR結(jié)合，阻遏HDAC6的翻譯，對于RUNX2的抑制作用減弱，促進骨分化[10]。

3 miRNA抑制MSC骨向分化的作用

miR NA對于骨分化也可以發(fā)揮抑制作用，主要是通過阻礙信號傳導(dǎo)通路的激活和抑制轉(zhuǎn)錄因子的翻譯。以下介紹一些Micro RNA作用靶點及信號通路。

3.1 BMP信號傳導(dǎo)通路 骨分化的經(jīng)典信號通路，作用于信號通路的靶點不同其作用也有所差異。BMPR2是BMP信號通路的重要受體，對于激活BMP通路起重要作用。miR-542-3p作為已知的腫瘤抑制劑，在促進骨分化的過程中發(fā)現(xiàn)miR-542-3p表達量降低明顯。發(fā)現(xiàn)miR-542-3p對于骨分化具有抑制作用，利用熒光素酶測定其作用的靶點為BMP-7，抑制BMP-7及其控制的BMP-7/PI3K/AKT信號通路進而抑制骨分化。動物實驗注射miR-542-3p、anti-miR-542-3p進一步驗證，得出anti-miR-542-3p促進骨分化，增加骨密度和骨強度，進一步驗證生物力學(xué)指標值，如極限力、能量和剛度[24]。

3.2 TGF-β信號傳導(dǎo)通路 作為信號傳導(dǎo)通路中的大家族，smad是TGF-β受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中介物質(zhì)。miR-155轉(zhuǎn)染BMP2誘導(dǎo)的成骨細胞系MC3T3-E1,利用qRT-PCR，14 d不同時間測量miR-155的表達，miR-155呈現(xiàn)一種降低趨勢，在第7天降低尤為明顯，并且呈現(xiàn)時間依賴性下調(diào)ALP活性和茜素紅染色降低。并使用熒光素酶測量證實miR-155結(jié)合于smad5 mRNA 3’端UTR結(jié)合，阻滯信號通路的傳導(dǎo)[25]。

3.3 Wnt/βcatenin信號傳導(dǎo)通路 LRP受體在Wnt/βcatenin起重要的作用。在成骨成脂誘導(dǎo)分化過程中，miR-30大家族具有明顯的促進脂肪分化，抑制成骨方向分化的作用。前成骨細胞MC3T3-E1過表達miR-30e 72 h后，抑制細胞的生長，并顯著降低RUNX2、ALP、osterix，而在miR-30e抑制劑轉(zhuǎn)染的前成骨細胞MC3T3-E1中出現(xiàn)相反的結(jié)果。通過熒光素酶測定其靶點為LRP6下調(diào)β-catenin抑制成骨方向分化[26]。2016年有實驗研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a轉(zhuǎn)染人BMSC，明顯抑制RUNX2、ALP、骨鈣素的表達，ALP染色，茜素紅染色減弱，通過targetscan粗略分析以及熒光素酶檢測miR-23a作用靶點LRP5，進一步過表達miR-23a蛋白和RNA含量LRP5、β-catenin、Axin2都有所降低，證明miR-23a通過靶向LRP5抑制Wnt/βcatenin信號通路抑制成骨[27]。

3.4 直接作用于骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子 RUNX2、OSX作為檢測骨分化的特異標志蛋白,同時促進骨分化。在敲除RUNX2基因的小鼠中，其成骨分化受到完全抑制，軟骨內(nèi)和膜內(nèi)骨化均不能發(fā)生，Osterix 缺失的小鼠無骨形成，但是具有軟骨內(nèi)骨結(jié)構(gòu)。說明RUNX2、OSX在骨分化起著關(guān)鍵作用。

在主動脈瓣間質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)miR-204過表達導(dǎo)致BMP-2誘導(dǎo)骨分化過程中RUNX2、ALP活性、OCN表達均有所降低，在成骨誘導(dǎo)細胞中qRT-PCR檢測miR-204的表達量約為正常對照組的15%，miR-204對于骨分化具有抑制作用。利用熒光素酶進一步檢測其作用靶點，檢測結(jié)果顯示miR-204靶向結(jié)合RUNX2，抑制miR-204表達則出現(xiàn)相反的結(jié)果[28](表2)。

表2 具有抑制作用的miRNA

文獻[29]利用miR-637、anti- miR-637、NC對照組瞬時轉(zhuǎn)染到人MSC中，測定細胞生長率以及檢測細胞周期分布，miR-637在人MSC中細胞生長抑制率為23%，anti- miR-637生長促進率為17%，NC對照組沒有明顯差異性，miR-637抑制hMSC生長并且誘導(dǎo)S期生長停滯。進而使用慢病毒載體穩(wěn)定恢復(fù)和沉默hMSCs中miR-637的表達，有研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-637轉(zhuǎn)染的細胞中，ALP活性顯示降低32%，鈣結(jié)節(jié)被抑制，而在沉默miR-637轉(zhuǎn)染的細胞中，ALP活性增加22%，并且增強鈣結(jié)節(jié)的形成，促進BMP2、RUNX2蛋白的表達。Targetscan、miRanda、Findtar推定以及熒光素酶驗證，miR-637靶向結(jié)合OSX。

綜上所述，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在干細胞分化過程中起著穩(wěn)定而復(fù)雜的作用。microRNA主要通過為作用于成骨相關(guān)的信號通路分子和直接作用于骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子從而對MSC成骨分化發(fā)揮促進/抑制作用。miRNA的高效，低損傷，低成本等優(yōu)點為臨床治療方法提供了一個全新的方向。但由于實驗動物種屬的差別和一些miRNA的作用機制尚不完全清楚。仍需大量的實驗檢測出高效、不良反應(yīng)少的miRNA，并希望早日用于臨床骨修復(fù)的治療。

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