李夢(mèng)媛，韋榮飛，楊星九，朱瑞敏，高 苒

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100121)

IL-37是IL-1家族細(xì)胞因子，曾經(jīng)被命名為IL-1F7[1]，在人體多種組織、器官中都有表達(dá)；在多種人源細(xì)胞系中也能夠檢測(cè)到IL-37，如THP-1、U937、A431、IMTLH、KG -1、HL60、HPBMC、HPT4和NHDC細(xì)胞等[2-4]。小鼠體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)IL-37同類細(xì)胞因子的表達(dá)[5]，因此小鼠及其來源的細(xì)胞系能夠排除背景干擾，作為較理想的對(duì)象應(yīng)用于IL-37的研究。IL-37共有6個(gè)外顯子，IL-37b是IL-37五種亞型a～e中序列最長的一個(gè)，全長的IL-37b共有218個(gè)氨基酸，含有外顯子1、2、4、5、6[6]，并在1號(hào)外顯子處有caspase-1酶切位點(diǎn)，能夠經(jīng)其切割轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨问降腎L-37b[7]，下文中分別將二者命名為FL-IL-37b(full-length-IL37b)與M-IL-37b(mature-IL-37b)。目前，大量研究已證明IL-37b具備生物學(xué)活性，能夠作為炎癥抑制因子在多種炎癥性疾病中發(fā)揮功能，同時(shí)，這些疾病引起的炎癥反應(yīng)也能夠上調(diào)IL-37b的表達(dá)[8-12]。本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的IL-37b真核表達(dá)載體旨在為人類炎癥性疾病病理機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)，并為疾病的治療方案提供潛在的新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

含有全長IL-37b編碼區(qū)基因的質(zhì)粒pUBC 2(+)以及載體質(zhì)粒pEGFP N1由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

T4連接酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；DNA分子量marker、PCR Premix Taq購自TaKaRa公司；RAW 264.7細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；IL-37抗體購自Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自中杉金橋生物公司；LPS(Lipopolysaccharide)購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol試劑購自Invitrogen公司；預(yù)染蛋白分子量marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、8孔腔室載玻片等購自Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司；SYBR green real-time PCR Master Mix購自Toyobo公司；熒光定量PCR儀專用96孔板與封板膜購自ABI公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI Step One Plus Real-Time PCR System；共聚焦顯微鏡為Leica Microsystems；引物合成與DNA測(cè)序服務(wù)由英濰捷基(上海)公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 IL-37b基因的克隆與pEGFP N1/IL-37b真核表達(dá)載體的構(gòu)建

全長與成熟形式的IL-37b基因模板來自本實(shí)驗(yàn)室制備的含IL-37b全長編碼區(qū)基因的質(zhì)粒pUBC/IL-37b。以該質(zhì)粒為模板，通過PCR技術(shù)對(duì)FL-IL-37b與M-IL-37b編碼區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增。上、下游引物序列見表1，下劃線為EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，預(yù)計(jì)目的基因片段大小分別為654 bp、519 bp。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，并對(duì)目的條帶DNA進(jìn)行回收，用于連接構(gòu)建真核表達(dá)載體。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I分別對(duì)目的基因的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pEGFP N1進(jìn)行雙酶切，再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過膠回收純化收集酶切產(chǎn)物，于16℃環(huán)境過夜連接，構(gòu)建表達(dá)載體。次日，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，吸取約200 μL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板上，在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑選若干菌落進(jìn)行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果后，將陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，鑒定IL-37b基因片段是否正確插入，陽性克隆質(zhì)粒命名為pEGFP N1/IL37b。

表1 IL-37b基因引物序列

1.2.2 RAW 264.7細(xì)胞的培養(yǎng)與表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染

將RAW 264.7細(xì)胞制成濃度為每毫升5×104個(gè)的細(xì)胞懸液，分別接種于8孔腔室載玻片與12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說明書步驟將pEGFP N1/IL-37b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至8孔腔室載玻片與培養(yǎng)板的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染完畢更換培養(yǎng)基后加入工作濃度為500 ng/mL的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h。

1.2.3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中IL-37b蛋白的表達(dá)

收集12孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解并提取蛋白。配制濃度為12%～15%的分離膠，將細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，減少非特異性結(jié)合后，按1∶1000的比例用IL-37抗體4℃孵育過夜。次日，用0.1%的PBST洗膜，加入按1∶5000比例稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫作用1 h。洗膜后加顯影液，觀測(cè)蛋白條帶。

1.2.4 共聚焦顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中IL-37b的表達(dá)與定位

棄去8孔腔室載玻片中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞后，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10 min。洗去多余的固定液，用0.2%的Triton X-100冰上通透細(xì)胞10 min。再次洗滌細(xì)胞后，用DAPI避光孵育細(xì)胞10 min，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色后用PBS洗滌細(xì)胞一次，除去8孔腔室，留下下方有細(xì)胞貼附的載玻片，用中性樹脂封片。待中性樹脂晾干后，在Leica共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞中FL-IL-37b與M-IL-37b的表達(dá)情況并拍照記錄。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IL-37b的抑制作用

收集12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞，按照TRIzol說明書與Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟提取細(xì)胞總RNA，并對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。通過real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-6的相對(duì)表達(dá)量。GAPDH與IL-6基因的引物序列如表2所示，real-time PCR的反應(yīng)體系如表3所示，反應(yīng)條件為：保溫，95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為60℃～95℃升溫。

表2 Real-time PCR引物序列

表3 Real-time PCR反應(yīng)體系

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism V.5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，以P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 IL-37b基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與重組質(zhì)粒的鑒定

M-IL-37b與FL-IL-37b基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，在500～750 bp之間有兩條明亮的條帶，一條接近500 bp，為M-IL-37b基因擴(kuò)增的產(chǎn)物；另一條約在650 bp附近，為FL-IL-37b基因擴(kuò)增的產(chǎn)物，與預(yù)期的目的基因大小相符。重組質(zhì)粒單克隆菌落PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，陽性的菌落在與M-IL-37b與FL-IL-37b基因相近的位置各有一條明亮的特異性條帶。對(duì)陽性克隆菌落進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示IL-37b基因片段正確插入pEGFP N1質(zhì)粒，堿基無突變，可進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

注：M：Marker；1：成熟IL-37b；2：全長IL-37b；3：陰性對(duì)照；4：成熟IL-37b陽性克隆菌落；5：全長IL-37b陽性克隆菌落。圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Note.M：Marker.1:M-IL-37b.2:FL-IL-37b.3:Negative control. 4: Positive colony of M-IL-37b. 5: Positive colony of FL-IL-37b.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products

2.2 重組表達(dá)載體在細(xì)胞中的表達(dá)

2.2.1 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中IL-37b蛋白的表達(dá)

如圖2所示，給予LPS刺激后，轉(zhuǎn)染的RAW 264.7細(xì)胞裂解液的Western blot結(jié)果顯示，有兩條特異性的蛋白條帶，位置分別在25 kDa與15 kDa附近，分別為FL-IL-37b與M-IL-37b，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符[8,13]。證實(shí)轉(zhuǎn)染后的RAW 264.7細(xì)胞中有M-IL-37b與FL-IL-37b的表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)染的RAW 264.7細(xì)胞中IL-37b的表達(dá)Fig.2 Expression of IL-37b protein in the transfected RAW 264.7 cells

2.2.2 共聚焦顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中IL-37b的表達(dá)與定位

如圖3所示，綠色為融合了綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的IL-37b，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核。轉(zhuǎn)染后，M-IL-37b主要在細(xì)胞核中表達(dá)，F(xiàn)L-IL-37b則在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中都有表達(dá)；LPS能夠在一定程度上誘導(dǎo)IL-37b表達(dá)上調(diào)。

圖3 帶GFP標(biāo)簽的IL-37b在RAW 264.7細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression of IL-37b with GFP tag in the transfected RAW 264.7 cells

2.3 Real time-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的RAW 264.7細(xì)胞對(duì)于LPS刺激的抑制作用

如圖4所示，real-time PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP N1/IL-37b質(zhì)粒的RAW 264.7細(xì)胞對(duì)于LPS刺激引起的促炎性細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)有抑制作用，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的對(duì)照組相比差異顯著，并且FL-IL-37b對(duì)于IL-6的抑制作用稍強(qiáng)于M-IL-37b。證實(shí)轉(zhuǎn)染的IL-37b能夠穩(wěn)定表達(dá)并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮炎癥抑制作用。

注：與LPS組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 LPS刺激轉(zhuǎn)染的RAW 264.7細(xì)胞中IL-6的表達(dá)(n=3)Note.Compared with the LPS group，*P<0.05；**P<0.01.Fig.4 Expression of IL-6 mRNA in the transfected RAW 264.7 cells stimulated by LPS

3 討論

Bulau等[7]研究發(fā)現(xiàn)，IL-37b的1號(hào)外顯子能夠編碼caspase-1酶切位點(diǎn)，IL-37b前體分子需要caspase-1切割修飾才能成為成熟分子移入細(xì)胞核參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控；突變導(dǎo)致caspase-1失活后，IL-37b不能進(jìn)入細(xì)胞核，并且對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用降低。成熟形式的IL-37b進(jìn)入細(xì)胞核后，能夠與Smad 3 (mothers against decapentaplegic homolog 3)結(jié)合形成功能性復(fù)合物影響基因轉(zhuǎn)錄，并抑制Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)誘導(dǎo)表達(dá)促炎癥性細(xì)胞因子，從而抑制樹突狀細(xì)胞的活化以及相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[8,14]。成熟形式的IL-37b的向細(xì)胞外分泌同樣需要caspase-1的作用，但LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌IL-37b前體分子的過程不依賴caspase-1[7,14]。用相應(yīng)的中和抗體中和IL-37b轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的IL-37b，并注射LPS誘導(dǎo)感染性休克，小鼠血清中IL-6的表達(dá)顯著升高，表明IL-37b的作用受到抗體拮抗，因而證實(shí)IL-37b能夠分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用，說明其在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中具有雙向功能[7]。

同為IL-1家族細(xì)胞因子的IL-18與其受體IL-18R結(jié)合形成的復(fù)合物能夠誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)。IL-37b與IL-18有很高的同源序列，無論是全長還是成熟形式的IL-37b都能夠與IL-18R的α鏈產(chǎn)生結(jié)合，且成熟形式IL-37b的結(jié)合能力較全長形式更強(qiáng)。但I(xiàn)L-18與IL-18Rα的結(jié)合能力比IL-37b成熟分子更強(qiáng)，因此IL-37b不能拮抗IL-18的功能。IL-18BP(IL-18 binding protein)是IL-18的天然抑制劑，能夠抑制IL-18與IL-18R的結(jié)合；成熟形式的IL-37b可以與IL-18BP結(jié)合，增強(qiáng)IL-18BP對(duì)IL-18信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制，從而抑制IFN-γ的表達(dá)[15-16]。近年來也有研究顯示IL-37b發(fā)揮作用需要IL-1家族細(xì)胞因子受體IL-1R8參與，IL-1R8可能與IL-18Rα一樣作為IL-37b的受體參與免疫應(yīng)答。此外，IL-37b還能夠通過抑制STAT1-4、c-Jun、p38 MARK、ERK等信號(hào)分子的磷酸化來調(diào)控促炎信號(hào)的傳導(dǎo)[17]。

本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的真核表達(dá)載體pEGFP N1/IL-37b含有SV40和CMV啟動(dòng)子及GFP標(biāo)簽，能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因并有利于檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，GFP有利于檢測(cè)全長與成熟形式的IL-37b在不同細(xì)胞器中的定位。實(shí)驗(yàn)中采用的RAW 264.7細(xì)胞系小鼠來源的單核巨噬細(xì)胞，自身并無IL-37表達(dá)，能夠排除以人源細(xì)胞系作為研究對(duì)象產(chǎn)生的背景干擾。LPS在體內(nèi)與體外都能夠誘導(dǎo)大量促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[8]，同時(shí)，在LPS刺激細(xì)胞后，IL-37b mRNA和蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，表明LPS能夠使IL-37b mRNA趨于穩(wěn)定[16]。Western blot與共聚焦顯微鏡觀測(cè)結(jié)果顯示構(gòu)建的FL-IL-37b與M-IL-37b的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后經(jīng)LPS誘導(dǎo)均可表達(dá)FL-IL-37b與M-IL-37b，其中M-IL-37b主要在定位于細(xì)胞核中，F(xiàn)L-IL-37b則在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中都有表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL-6的表達(dá)降低，表明轉(zhuǎn)染后FL-IL-37b與M-IL-37b能夠在細(xì)胞中發(fā)揮炎癥抑制作用。上述結(jié)果與已報(bào)導(dǎo)的文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)相符，證實(shí)構(gòu)建的pEGFP N1/IL-37b能夠穩(wěn)定的表達(dá)相應(yīng)的IL-37b，為進(jìn)一步研究IL-37b在炎癥反應(yīng)中的發(fā)揮的作用及其細(xì)胞內(nèi)外機(jī)制提供了便利。

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