李俏俏 李隆祥 羅建華 王晨 潘君素

重癥社區(qū)獲得性肺炎（SCAP）病死率高，醫(yī)療費(fèi)用高，是臨床醫(yī)生經(jīng)常需要面對(duì)的棘手問(wèn)題.對(duì)于SCAP在重視抗菌藥物合理治療的同時(shí)更應(yīng)強(qiáng)調(diào)全身綜合治療，包括免疫調(diào)節(jié)治療。Toll樣受體（TLR）家族作為人體固有免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨膜受體及模式識(shí)別受體之一，可以識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式，繼發(fā)產(chǎn)生大量炎癥因子，從而在宿主防御中發(fā)揮重要作用。TLR家族具有多個(gè)成員，至今已發(fā)現(xiàn)15種TLRs，研究表明TLR4、TLR5、TLR9在革蘭陰性菌引起的炎癥反應(yīng)中起重要作用，其中研究最為深入的是TLR4，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞上，是脂多糖（LPS）的天然受體[1]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究的較清楚的是TLR4與LPS介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其在內(nèi)毒素耐受產(chǎn)生中亦起關(guān)鍵作用[2]。而SCAP患者外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)和炎性因子釋放及體外LPS刺激后TLR4和炎性因子的表達(dá)情況及可能的臨床意義，目前報(bào)道較少。本研究旨在探討SCAP患者外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)情況及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2014年1月至2015年1月入住本院呼吸科（15例）及 ICU（35例）的 SCAP患者共 50例（SCAP組），其中男34例，女16例，年齡38～75歲（65±7）歲；根據(jù)肺炎嚴(yán)重程度評(píng)分系統(tǒng)[3]將SCAP組患者按照總分≤50分、51～70分、71～90分、91～130分和＞130分，分為Ⅰ級(jí)（1例）、Ⅱ級(jí)（4例）、Ⅲ級(jí)（23例）、Ⅳ級(jí)（17例）和Ⅴ級(jí)（5例），并按Ⅰ～Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)分別劃為低、中、高危者。入選標(biāo)準(zhǔn)：均為社區(qū)獲得性肺炎患者，未到其他醫(yī)院治療；符合美國(guó)感染性疾病學(xué)會(huì)/美國(guó)胸科學(xué)會(huì)2007年頒布的成人社區(qū)獲得性肺炎管理指南中危重癥的分型標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：院內(nèi)獲得性重癥肺炎患者，有明確腫瘤病史；長(zhǎng)期服用激素、免疫制劑史及免疫缺陷史。選取同期本院健康體檢者50例作為對(duì)照組，其中男 32 例，女 18 例，年齡 35～71（62±9）歲。兩組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分析 入院48h內(nèi)32例SCAP患者獲取合格痰標(biāo)本，另18例獲取經(jīng)氣管插管防污染毛刷標(biāo)本，對(duì)這些標(biāo)本進(jìn)行病原菌分析。

1.2.2 外周血單核細(xì)胞的分離和鑒定 抽取兩組受試者入院第1天空腹外周靜脈血20ml，肝素抗凝并分離血清后，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞懸液置于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育2h后，獲得貼壁單核細(xì)胞，加入1640完全培養(yǎng)液（武漢普諾賽生命科技有限公司，PM150110，500ml），培養(yǎng)12d后備用。在倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯，BX53）下觀察細(xì)胞形態(tài)，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD14陽(yáng)性單核細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.3 cDNA模板的合成 本實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒、生物酶、基因及引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司提供。采用組織和細(xì)胞總RNA提取法（TRIzol法）提取單核細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，反應(yīng)體系包括：1μg樣本 RNA，水 10μl，RT 緩沖液 5μl，10mM 脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1.25μl，40U/L RNA 酶抑制劑0.5μl，經(jīng) 42℃ 15min，72℃ 5min，4℃ 5min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA模板-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 TLR4 mRNA表達(dá)量及炎癥因子水平的測(cè)定 采用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定TLR4 mRNA的表達(dá)量，反應(yīng)體系包括：cDNA 模板 2μl，水 1μl，1μM 的正向引物1.5μl，1μM 的反向引物 1.5μl，DNA 酶 0.5μl，PCR 反應(yīng)混合液（PCR Master Mix）5μl，經(jīng)預(yù)變性：95℃，30s；變性：95℃，5s；退火：60℃，30s；延伸：72℃，30s；再延伸：72℃，1min；最后延伸：55℃，30s，循環(huán) 40 次，獲得 PCR產(chǎn)物TLR4 mRNA，以內(nèi)參GAPDH基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，以2-△△Ct法計(jì)算TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。TLR4及內(nèi)參引物見(jiàn)表1。取分離出的血清，采用ELISA法測(cè)定 TNF-α、IL-6、IL-8、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）水平，具體操作步驟按試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在1640完全培養(yǎng)液中，進(jìn)行重懸單核細(xì)胞，加入LPS 40g/ml，培養(yǎng)皿放置于 37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24h，然后收集單核細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后離心，分離血清，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)TLR4 mRNA的表達(dá)量，ELISA法檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、PCT 水平。

表1 T L R 4及內(nèi)參引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCAP組標(biāo)本分離出的病原體 見(jiàn)表2。

表2 S CA P組標(biāo)本分離出的病原體[例（%）]

由表2可見(jiàn)，SCAP組病原體主要為革蘭陰性菌，占84.00%，分別是銅綠假單胞菌12例（24.00%）、鮑曼不動(dòng)桿菌11例（22.00%）、肺炎克雷伯菌9例（18.00%）、大腸桿菌10例（20.00%）。

2.2 兩組在LPS刺激前、后外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)量及血清炎癥因子水平比較 見(jiàn)表3。

表3 兩組在L P S刺激前、后外周血單核細(xì)胞T L R 4m R N A表達(dá)量及血清炎癥因子水平比較

由表3可見(jiàn)，LPS刺激前SCAP組外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，血清TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、PCT水平亦高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。LPS刺激后，兩組TLR4 mRNA表達(dá)量和血清 TNF-α、IL-6、IL-8、CRP 水平均較刺激前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但PCT的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 SCAP組PSI評(píng)分與外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)量的相關(guān)性分析 SCAP組低危28例，TLR4 mRNA表達(dá)量8.03±3.17；中危17例，TLR4 mRNA表達(dá)量10.49±4.35；高危 5例，TLR4 mRNA 表達(dá)量 12.98±2.96。由此可見(jiàn)SCAP組PSI評(píng)分越高，TLR4 mRNA表達(dá)量也越高，兩者呈正相關(guān)性（r=0.641，P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1。

圖1 S CA P組外周血單核細(xì)胞T L R 4m R N A表達(dá)量與P S I評(píng)分的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

本研究中SCAP組痰標(biāo)本中分離出的病原菌主要是革蘭陰性菌，占84.00%，分別是銅綠假單胞菌（24.00%）、鮑曼不動(dòng)桿菌（22.00%）、肺炎克雷伯菌（18.00%）、大腸桿菌（20.00%）。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁上主要的致病成分，LPS進(jìn)入人體后能與單核細(xì)胞TLR4相結(jié)合，誘導(dǎo)宿主促炎和抗炎因子失衡性表達(dá)，進(jìn)而發(fā)生多臟器功能衰竭，這也是重癥肺炎死亡的原因之一[4]。TLR4作為L(zhǎng)PS的模式識(shí)別受體，起著啟動(dòng)炎性反應(yīng)的作用，因此TLR4過(guò)量表達(dá)與革蘭陰性菌感染所致的SCAP密切相關(guān)[5]。

正常情況下，TLR4主要表達(dá)于單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞上，以內(nèi)毒素結(jié)合蛋白-CD14-TLR4三聚體的形式識(shí)別LPS，并直接啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的相關(guān)信號(hào)通路。TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有髓樣細(xì)胞分化因子88（MyD88）依賴和MyD88非依賴兩條途徑。MyD88依賴性信號(hào)通路[6]，主要介導(dǎo)核因子-κB（NF-κB）的活化，激活的NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，最后導(dǎo)致 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子和調(diào)節(jié)因子的表達(dá)與生成，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TLR4亦可激活MyD88非依賴性信號(hào)通路[7]，即含TIR結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)干擾素B-接頭蛋白（IFNB-TRIF）依賴性信號(hào)通路。TLR4與TRIF相關(guān)接頭分子（TRAM）連接，隨即從細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)與TRIF相互作用，TRIF進(jìn)而與TRAF3和TRAF6聯(lián)合，激活TANK結(jié)合激酶1（TBK1）與IKKe，活化干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），誘導(dǎo)干擾素B的轉(zhuǎn)錄。此外，TRAF6亦可通過(guò)受體相互作用蛋白1（RIP1）激活NF-κB和MAPK，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子合成和釋放。但是過(guò)度的炎癥反應(yīng)可損傷機(jī)體正常組織細(xì)胞，引起多臟器功能不全。因此，測(cè)定TLR4 mRNA的表達(dá)量及下游炎癥因子的水平,對(duì)SCAP病理機(jī)制的研究有著重要的意義。

本研究結(jié)果顯示，SCAP組TLR4 mRNA的表達(dá)量及血清炎癥因子水平均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明SCAP組患者體內(nèi)TLR4 mRNA表達(dá)量升高，并與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這與Zhang等[8]的研究結(jié)果一致。高翔等[9]的研究表明，PCT是影響老年重癥肺炎患者預(yù)后的重要指標(biāo)，但在本實(shí)驗(yàn)中，SCAP組加入LPS刺激前后PCT的水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能提示PCT并非是TRL4介導(dǎo)的下游炎癥因子。Dou等[6]認(rèn)為，NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是LPS所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的下游通路。TLR4主要通過(guò)活化核因子NF-κB，從而激活呼吸道上皮細(xì)胞，增加黏附分子表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致呼吸道的慢性炎癥及組織器官損害，這說(shuō)明TLR4/NF-κB通路可能是觸發(fā)炎癥反應(yīng)和器官損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究因條件限制，未能對(duì)NF-κB表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析，有待進(jìn)一步探討。

本研究表明，在LPS刺激后SCAP組和對(duì)照組TLR4 mRNA的表達(dá)量及血清炎癥因子水平均增高，但SCAP組增幅僅為對(duì)照組的2%～18%，提示SCAP患者外周血單核細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)受損，氣道定植菌長(zhǎng)期刺激外周血單核細(xì)胞TLR4及NF-κB信號(hào)通路處于活化狀態(tài)，導(dǎo)致TLR4下調(diào)，降低了患者單核細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)性，最終形成內(nèi)毒素耐受，這與Mendes等[10]的研究結(jié)果一致。內(nèi)毒素耐受是革蘭陰性菌感染時(shí)機(jī)體重要的保護(hù)機(jī)制，能夠明顯減輕“二次打擊”帶來(lái)的損傷，對(duì)于提高重癥肺炎患者生存率和改善預(yù)后具有積極意義。TLR4作為介導(dǎo)LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體，其表達(dá)量和功能下調(diào)及TLR4信號(hào)通路中各個(gè)環(huán)節(jié)的功能缺陷，都將導(dǎo)致內(nèi)毒素耐受產(chǎn)生。陳華文等[11]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS預(yù)處理確實(shí)具有誘導(dǎo)“內(nèi)毒素耐受”的能力,能夠減輕內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的肺損傷,其機(jī)制可能與抑制了炎癥反應(yīng)和氧自由基生成有關(guān)。另有研究表明，TLR4拮抗劑可通過(guò)降低LPS對(duì)TLR4的刺激，其機(jī)制是抑制NF-κB活化，下調(diào)促炎細(xì)胞因子的釋放，從而減少肺組織損傷[12]。TANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)分析TLR4的表達(dá)量與老年重癥肺炎患者的病死率相關(guān)。

綜上所述，TLR4位于炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最上游環(huán)節(jié)，當(dāng)革蘭陰性菌感染引起SCAP時(shí)，TLR4 mRNA表達(dá)量顯著增高，在啟動(dòng)抗感染的固有免疫中起關(guān)鍵作用。對(duì)TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的進(jìn)一步研究，將有助于我們更加明確疾病機(jī)制，從而為臨床預(yù)防和治療細(xì)菌感染提供新的思路和方法，TLR4拮抗劑有望成為SCAP診治中新的分子治療靶點(diǎn)。

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