許超超 金嶸 顏小丹 葉麗萍

據(jù)Jemal等[1]報(bào)道，2008年世界范圍有近10萬(wàn)例新發(fā)胃癌患者和73萬(wàn)余例胃癌患者死亡，超過(guò)70%的新發(fā)和死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，其中發(fā)病率最高的是在亞洲東部、東歐和南美。雖然外科手術(shù)和術(shù)后輔助化療已經(jīng)改善了胃癌患者的預(yù)后，但是胃癌的總體存活率并不令人滿(mǎn)意。因此，了解胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的靶向治療藥物是必要的。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 1（fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1）是一種高度保守的酪氨酸激酶（RTK）受體，通過(guò)與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFs）結(jié)合，可以激活下游的一系列通路，在腫瘤細(xì)胞的分化、增殖以及腫瘤血管的生成中起到重要作用[2]。已有研究報(bào)道，F(xiàn)GFR1在胃癌組織中呈高表達(dá)，且在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[3]。進(jìn)一步研究表明，在胃腺癌中FGFR1高表達(dá)與否與胃癌患者的 10年生存率相關(guān)[4]；而且Wen等[5]和 Xu等[6]發(fā)現(xiàn)FGFR1不僅在胃癌組織中是擴(kuò)增的，在胃癌細(xì)胞中也是擴(kuò)增的，當(dāng)FGFR1被小分子抑制劑L6123抑制或miR-133b沉默后，可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖。本研究采用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA） 介導(dǎo)FGFR1基因沉默來(lái)探討其對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)及凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；人胃癌細(xì)胞SGC-7901購(gòu)于中南大學(xué)湘雅細(xì)胞中心；人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1均用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；所有細(xì)胞株均在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（條件為：37℃、5%CO2、濕度 95%），每隔 1～2d 更換新鮮的培養(yǎng)基，并在細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，進(jìn)行傳代、凍存或者下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中FGFR1蛋白的表達(dá)情況 根據(jù)Genbank中提供的FGFR1基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)siRNA的序列，靶向FGFR1的siRNA序列：5′-GGAGGUGCUUCACUUAAGATT-3′，陰性對(duì)照（NC）的 siRNA 序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的胃癌細(xì)胞SGC-7901，分3組：NC-siRNA組（轉(zhuǎn)染NC的siRNA）、siRNA-FGFR1組（轉(zhuǎn)染靶向FGFR1的siRNA）及空白組（加入相應(yīng)劑量的滅菌水），先用250μl無(wú)血清的培養(yǎng)基分別與Lipofectamine2000（5μl）和 siRNA（5μl）各自混合均勻，再將Lipofectamine2000和siRNA混合均勻，最后將混合后的Lipofectamine2000和siRNA加入6孔板中，采用無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)6h后換成有血清的培養(yǎng)基；2d后收蛋白，采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中FGFR1蛋白的表達(dá)情況。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，分3組，NC-siRNA組、siRNA-FGFR1組及空白組，接種于96孔板（每孔3000～5000個(gè)細(xì)胞），用配置好的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；在鋪板后的 0、24、48h，觀(guān)察每組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并在每個(gè)小孔中加入配置好的 MTT（5mg/ml）25μl，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4h，之后加入150μlDMSO用來(lái)溶解結(jié)晶，最后酶標(biāo)儀490nm下讀取OD值，檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。

1.2.3 克隆集落形成試驗(yàn)檢測(cè)增殖情況 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的胃癌細(xì)胞SGC-7901，鋪于6孔板中（1000個(gè)/孔）并輕輕搖晃，使細(xì)胞分散均勻，靜置培養(yǎng)2周；當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，即可終止培養(yǎng)，棄去上清液，用PBS小心浸洗1次，加4%多聚甲醛固定15min，然后去固定液，用PBS再次小心浸洗1次，最后用結(jié)晶紫染色20min，用PBS洗去染色液，待干燥后觀(guān)察并拍照，觀(guān)察細(xì)胞集落形成的大小。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的胃癌細(xì)胞SGC-7901，鋪于6孔板中培養(yǎng)，貼壁過(guò)夜；培養(yǎng)48h后，收取原先的培養(yǎng)基和清洗所用的PBS，然后再收集貼壁的胃癌細(xì)胞，4℃、1000r/min，離心4min，棄上清液，并用PBS清洗1次后，繼續(xù)相同條件下離心，保留沉淀，最后加入200μl Binding-buffer重懸沉淀；接著取100μl的細(xì)胞重懸液，先用Annexing-V（3μl）染色 10min，接著用 PI（1μl）繼續(xù)染色 5min，最后用Binding-buffer混合均勻后在流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Hoechst染色法分析細(xì)胞凋亡情況 取經(jīng)70%乙醇浸泡過(guò)的蓋玻片，用PBS洗滌以及酒精燈上過(guò)火消毒后放置在6孔板中，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的胃癌細(xì)胞SGC-7901接種于6孔板上（30～40萬(wàn)個(gè)/孔），過(guò)夜貼壁，分3組，NC-siRNA組、siRNA-FGFR1組及空白組；培養(yǎng)48h，吸盡培養(yǎng)基后并用固定液固定15min，PBS清洗7min×3次，加入500μl的Hoechst染色液，避光染色10min后繼續(xù)用PBS清洗7min×3次，最后加入適量的抗熒光淬滅劑，并在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGFR的表達(dá)量及siRNA轉(zhuǎn)染效果 見(jiàn)圖1。

由圖1a可見(jiàn)，與人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1（OD值：0.19±0.03）相比，F(xiàn)GFR1蛋白在胃癌細(xì)胞 SGC-7901（OD 值：0.77±0.08）中表達(dá)增高（t=6.69，P＜0.05）。由圖 1b可見(jiàn)，與空白組（OD 值：0.96±0.08）相比，NC-siRNA組（OD 值：0.88±0.13）對(duì)FGFR1蛋白表達(dá)的抑制差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.71，P＞0.05）；而siRNA-FGFR1組（OD值：0.15±0.05）顯著抑制了FGFR1蛋白的表達(dá)（t=12.55，P＜0.01）。

圖1 Western blotting法檢測(cè)FGFR1蛋白的表達(dá)量

2.2 SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)細(xì)胞增殖的影響 見(jiàn)圖 2、3。

圖2 SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-RNA后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖3 克隆集落形成試驗(yàn)檢測(cè)S GC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-RNA后細(xì)胞集落形成能力

由圖2可見(jiàn)，在轉(zhuǎn)染后的48h，空白組（OD值：0.62±0.03）和 NC-siRNA 組（OD 值：0.52±0.07）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.37，P＞0.05），siRNA-FGFR1組（OD值：0.27±0.04）與空白組相比，細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯抑制（t=12.21，P＜0.01）。由圖3可見(jiàn)，siRNA-FGFR1組SGC-7901克隆集落形成在3組中最小，克隆集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響見(jiàn)圖 4、5。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染s i-R N A后細(xì)胞的凋亡情況

由圖 4可見(jiàn)，空白組（1.06±1.35）與 NC-siRNA 組（5.70±1.03）中胃癌SGC-7901細(xì)胞早期凋亡百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.86，P＞0.05），而 siRNA-FGFR1組（27.65±3.49）較空白組細(xì)胞早期凋亡百分比顯著升高（t=10.05，P＜0.01）。由圖 5可見(jiàn)，Hoechst染色法的檢測(cè)呈現(xiàn)出同樣的結(jié)果，siRNA-FGFR1組顯著增加了細(xì)胞核裂解和濃縮的比例，細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，可見(jiàn)核呈分葉，碎片狀改變。

3 討論

FGFRs是酪氨酸激酶受體,由胞外配體結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域3部分組成，目前已經(jīng)有4種受體蛋白被發(fā)現(xiàn)（FGFR 1～4）。FGFRs的突變激活或過(guò)量表達(dá)與包括乳腺癌、膀胱癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌、腎細(xì)胞癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)展及腫瘤周?chē)艿纳擅芮邢嚓P(guān)。

圖5 Hoechst 33258檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-RNA后細(xì)胞核形態(tài)的變化

在FGFR1擴(kuò)增的腫瘤中，小分子ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或siRNA可通過(guò)下調(diào)FGFR1的表達(dá)來(lái)發(fā)揮良好的抗腫瘤效果。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)FGFR1在非小細(xì)胞肺癌中是高表達(dá)的，當(dāng)FGFR1被小分子抑制劑（AZD4547、NDGA類(lèi)似物等）下調(diào)后可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[7-9]。同樣是肺癌，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在小細(xì)胞肺癌中FGFR1也是高表達(dá)的，且與肺癌患者的生存率密切相關(guān)[10-11]。在乳腺癌中，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)FGFR1的高表達(dá)與患者的預(yù)后、腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，且PD166866（FGFR1小分子抑制劑）可以有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[12-15]。Koole等[16]發(fā)現(xiàn)在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中（不管是否存在人類(lèi)乳頭瘤病毒感染），F(xiàn)GFR1都是高表達(dá)的，而且FGFR抑制劑不僅可以抑制癌細(xì)胞增殖，還可以與化療藥物聯(lián)合而發(fā)揮更明顯的抗腫瘤效果。因此FGFR1在癌癥的治療中可以作為一個(gè)有效的靶點(diǎn)。

為了特異性地研究FGFR1對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究選擇FGFR1相對(duì)表達(dá)量較高的胃癌細(xì)胞株SGC-7901作為基因沉默研究模型。Western blotting證實(shí)siRNA-FGFR1可顯著抑制FGFR1蛋白的表達(dá)；并在FGFR1蛋白表達(dá)受到穩(wěn)定沉默后，胃癌細(xì)胞時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染后的48h細(xì)胞增殖受到明顯抑制，而且克隆集落實(shí)驗(yàn)也表明siRNA-FGFR1成功抑制了胃癌細(xì)胞克隆集落的形成；此外在促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，siRNA-FGFR1可以顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的早期凋亡，而且通過(guò)Hoechst染色法發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞的形態(tài)學(xué)方面，當(dāng)FGFR1被沉默后胃癌細(xì)胞SGC-7901的細(xì)胞核裂解和濃縮的比例也較空白組有增加。

本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了以FGFR1為目的基因,通過(guò)siRNA技術(shù)成功抑制了其在胃癌細(xì)胞SGC-7901中的表達(dá)，同時(shí)發(fā)揮了顯著的抑制胃癌增殖以及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的抗腫瘤效果，但是其潛在機(jī)制有必要進(jìn)一步研究，而這也正是下一步筆者研究的重點(diǎn)，除此之外，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是癌癥進(jìn)展的核心過(guò)程，與癌細(xì)胞侵犯間質(zhì)組織并遷移到其他區(qū)域的能力有關(guān)，最近已有研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，F(xiàn)GFR1抑制劑可以通過(guò)核轉(zhuǎn)染因子AP-1來(lái)影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[17-18]；筆者前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)siRNA-FGFR1可以抑制胃癌細(xì)胞的侵襲[6]，但是否與EMT以及AP-1有關(guān)，則需要進(jìn)一步研究，以確定并闡明潛在的機(jī)制。

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