徐靜 金曉潔 繆志海 夏斌 戴元榮

支氣管哮喘是呼吸系統(tǒng)常見的疾病，近年來，發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。支氣管哮喘是由多種細胞以及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，雖然其發(fā)病機制目前尚不完全清楚，但研究表明，與環(huán)境因素、遺傳背景和免疫調(diào)節(jié)紊亂等諸多因素有關(guān)[2]。目前，臨床上對于支氣管哮喘的治療主要選用吸入性糖皮質(zhì)激素和β2受體激動劑，但長期應(yīng)用會使患者出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、免疫功能下降等不良反應(yīng)[3]。因此，探討支氣管哮喘的發(fā)病機制對于提高臨床治療的有效性，降低患者不良反應(yīng)的發(fā)生均具有十分重要的指導(dǎo)意義。已有研究顯示，在支氣管哮喘的發(fā)病過程中，細胞免疫因子起到了調(diào)控、延續(xù)以及級聯(lián)放大炎性反應(yīng)的重要作用[4]。同時，已有研究表明，在支氣管哮喘動物模型中，氣道適應(yīng)性的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)均與T細胞的產(chǎn)生密切相關(guān)[5]。因此，本研究對支氣管哮喘小鼠細胞免疫因子（IL-4、IL-5和IFN-γ）及輔助性T細胞（Th）17細胞水平（IL-10和IL-17）的變化及發(fā)病機制進行探討，旨在為支氣管哮喘的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選擇SPF級昆明種小鼠24只，雄性，6～8周，體質(zhì)量（20±2）kg。采用隨機數(shù)字表法分為哮喘模型組和正常對照組各12只。哮喘模型組小鼠平均體質(zhì)量（20.86±0.79）kg，正常對照組小鼠平均體質(zhì)量（20.59±0.86）kg，兩組小鼠平均體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑 卵清蛋白（OVA）購自美國Sigma公司，規(guī)格：100mg，批號：Sigma-A5503。IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10、IL-17的ELISA試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司。

1.3 主要儀器和設(shè)備 美國Wescor離心涂片機（型號：CYTOPRO7620）購自北京艾澤信科技公司；奧林巴斯顯微鏡（型號：BX43）購自上海賴氏電子有限公司；博科超低溫冰箱（型號：BDF-25V270F）、博科垂直流凈化工作臺（型號：BBS-SDS）購自山東濟南鑫澤銘醫(yī)療器械有限公司；臺式高速離心機（型號：TG16-WS/TG16WS）購自長沙市湘儀離心機儀器有限公司；精密恒溫水浴鍋（JHH4A）購自上海冠森生物科技有限公司；超靈活濾片式FilterMax F3多功能酶標儀購自上海美谷分子儀器有限公司；25、50、100、200μl賽默飛世爾單道可調(diào)移液槍購自山東濟南來寶醫(yī)療器械有限公司。

1.4 小鼠哮喘模型的建立[6]哮喘模型組小鼠分別于實驗開始當(dāng)天和第8天腹腔內(nèi)注入OVA混懸液[含OVA/Al（OH）310mg/g]50μg/次致敏，并于第16天給予霧化吸入含1%OVA的0.9%氯化鈉溶液30～40ml進行激發(fā)，持續(xù)30～40min，1次/d，連續(xù)7d。正常對照組小鼠則給予等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 支氣管肺泡灌洗液（BALF）和外周血血清的收集及制備 兩組小鼠均在最后一次激發(fā)后24h，眼球取血處死，固定，打開胸腔行氣管插管，對左側(cè)主支氣管進行結(jié)扎，采用磷酸鹽緩沖液（PBS）行支氣管肺泡灌洗3次，3～4ml/次，回收率均為80%以上。收集BALF，室溫1200r/min 離心 5～10min，取上清液，-80℃冰箱保存，備用。外周血通過眼球取血獲得，室溫1200r/min離心5～10min，取上清液，-80℃冰箱保存。

1.6 BALF中炎性細胞計數(shù) 將收集到的BALF采用離心涂片機進行細胞收集，HE染色后，在顯微鏡下進行炎性細胞總數(shù)和分類計數(shù)。

1.7 細胞免疫因子及Th17細胞水平檢測 采用ELISA法檢測兩組小鼠外周血及BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17水平。所有實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠行為的比較 正常對照組小鼠行動自如，未見異常。哮喘模型組小鼠致敏后活動少，可見明顯的扭體反應(yīng)；激發(fā)過程中小鼠精神狀態(tài)欠佳，以俯臥為主，并可見不同程度的頭面部瘙癢，呼吸急促，鼻翼煽動，煩躁不安，腹肌抽搐以及大小便失禁等癥狀。

2.2 兩組小鼠肺組織病理切片HE染色結(jié)果的比較正常對照組小鼠肺組織中氣道內(nèi)纖毛上皮排列整齊，黏膜皺壁未見水腫，結(jié)構(gòu)清晰，支氣管周圍無炎性細胞浸潤，僅可見極少量的杯狀細胞，無明顯黏液分泌，見圖1a。哮喘模型組小鼠肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見大量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，且支氣管周圍已被大量的炎性細胞浸潤，氣道上皮組織結(jié)構(gòu)紊亂，其內(nèi)可見大量杯狀細胞增生，大量黏液分泌并形成黏液栓，相對陽性著色面積增大，見圖1b。

圖1 兩組小鼠肺組織病理切片（a：正常對照組小鼠肺組織；b：哮喘模型組小鼠肺組織；H E染色，×200）

2.3 兩組小鼠BALF中炎性細胞分類計數(shù)的比較 與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞分類計數(shù)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 兩組小鼠B A L F中炎性細胞分類計數(shù)比較

2.4 兩組小鼠BALF和血清中細胞免疫因子表達水平的比較 與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5和IFN-γ水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組小鼠B A L F和血清中細胞免疫因子表達水平的比較

2.5 兩組小鼠BALF和血清中Th17細胞水平的比較與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF和血清中IL-10水平明顯降低，而IL-17水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組小鼠B A L F和血清中T h17細胞水平的比較（n g/L）

3 討論

3.1 細胞免疫因子在支氣管哮喘發(fā)病中的作用 免疫細胞因子在機體的免疫過程中扮演著十分重要的角色。本研究結(jié)果表明，與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF和血清中IL-4、IL-5和IFN-γ水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。仕麗等[7]探討定喘止哮顆粒對支氣管哮喘模型組大鼠血清中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的影響，結(jié)果表明定喘止哮顆粒能夠明顯增加支氣管哮喘模型組大鼠血清中IFN-γ水平，降低IL-4、IL-5水平，主要通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞之間功能平衡，從而達到減輕氣道炎性反應(yīng)的作用。

3.2 Th17細胞在支氣管哮喘發(fā)病中的作用 隨著環(huán)境問題的日益惡化，我國支氣管哮喘的發(fā)病率已呈逐年上升趨勢，且嚴重影響了患兒的免疫功能，給治療帶來了極大的困難，給家屬帶來了極大的負擔(dān)[8-9]。Th17細胞分泌的IL-17是較為強大的促炎細胞因子，其能夠促進多種細胞釋放炎性因子而致使炎癥反應(yīng)[10]。細胞因子IL-10則具有抗炎作用，能夠有效抑制促炎細胞因子的合成[11]。本研究結(jié)果表明，與正常對照組小鼠相比，哮喘模型組小鼠BALF和血清中IL-10水平明顯降低，而IL-17水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。魏秀娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者相比，緩解期支氣管哮喘患者和急性發(fā)作期支氣管哮喘患者血清中IL-17水平明顯升高，同時急性發(fā)作期患者血清中IL-17水平明顯高于緩解期患者，從而表明血清中IL-17水平的高表達可能與支氣管哮喘的形成有關(guān)，并對疾病的進程產(chǎn)生一定的影響。張艷麗等[13]采用ELISA法檢測正常健康兒童、哮喘急性發(fā)作患兒、哮喘緩解患兒血清中IL-10水平，結(jié)果表明哮喘發(fā)作患兒較哮喘緩解患兒和正常健康兒童血清IL-10水平明顯提高。

綜上所述，支氣管哮喘小鼠肺組織內(nèi)可見大量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，且相對陽性著色面積增大，同時BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞分類計數(shù)均明顯升高，可能與BALF和血清中IL-4、IL-5、IFN-γ和IL-17水平明顯升高，而IL-10水平明顯降低密切相關(guān)。本研究還存在不足之處，如研究例數(shù)較少等，另外對支氣管哮喘小鼠的免疫機制有待進一步的研究。

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