張蟄春 劉 陽

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東廣州 510275）

基因作為生命信息的載體，是研究生物微進(jìn)化的基本單位。在生物進(jìn)化的過程中，基因突變?yōu)樽匀贿x擇提供“原材料”，而適應(yīng)性突變在自然選擇中被保留下來。不同的物種間或者同一物種的不同個(gè)體間的基因組都存在遺傳變異，這些可積累的突變是自然選擇留下的“痕跡”。通過適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法檢測遺傳變異在種內(nèi)和種間的分布規(guī)律，可以幫助推斷自然選擇的類型和強(qiáng)度。尤其是對于編碼蛋白質(zhì)的候選基因或功能基因（candidate gene）的進(jìn)化研究，往往從其功能背景出發(fā)，在分析基因結(jié)構(gòu)的同時(shí)探討它們所受到的自然選擇，以期找到遺傳變異位點(diǎn)的功能變化和適應(yīng)性。

先天性免疫（innate immune system）是生物出生后便擁有的非特異性免疫能力，具有遺傳性。先天性免疫是一種古老的免疫方式，早在后口動(dòng)物中就出現(xiàn)了，并繼續(xù)在更高等的動(dòng)物中進(jìn)化。先天性免疫的原理是機(jī)體對病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）進(jìn)行識別［1］，經(jīng)過一系列的細(xì)胞外及細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)并最終啟動(dòng)免疫防御機(jī)制。顯然，免疫應(yīng)答是動(dòng)物宿主與病原體之間發(fā)生直接“沖突”的過程，這就導(dǎo)致了宿主先天性免疫系統(tǒng)與病原體可能向不同方向進(jìn)化［2］。目前，如何從調(diào)控免疫系統(tǒng)的相關(guān)功能基因出發(fā)，研究宿主與病原體的協(xié)同進(jìn)化，已成為微進(jìn)化研究的熱點(diǎn)之一。

Toll 樣受體（Toll-like receptors，以下簡稱“TLRs”）是先天性免疫系統(tǒng)的重要受體，其基本功能是識別不同的病原體，并在它們?nèi)肭謾C(jī)體時(shí)快速激活非特異性免疫。由于Toll 樣受體在先天性免疫上的重要作用，揭示了Toll 樣受體作用分子機(jī)理的3 位免疫學(xué)家，美國學(xué)者布魯斯·博伊特勒（Bruce A. Beutler）、法國學(xué)者朱爾斯·霍夫曼（Jules A. Hoffmann）和加拿大學(xué)者拉爾夫·斯坦曼（Ralph M. Steinman）共同被授予了2011年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。本文通過介紹Toll 樣受體的結(jié)構(gòu)和功能，并重點(diǎn)綜述Toll 樣受體基因在脊椎動(dòng)物中的微進(jìn)化研究進(jìn)展和前景，以期增進(jìn)讀者對脊椎動(dòng)物中免疫相關(guān)的功能基因及其調(diào)節(jié)機(jī)制的了解。

1 Toll 樣受體的結(jié)構(gòu)特征及其配體

Toll 樣受體作為先天性免疫系統(tǒng)中為數(shù)不多的特異性受體，其特異性程度遠(yuǎn)比想像中高。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，它有能力區(qū)分“自我”和“異己”。TLRs 是Ⅰ型膜整合蛋白，即單次跨膜蛋白，其基本結(jié)構(gòu)包括胞外域、單次跨膜區(qū)及胞內(nèi)域。TLRs的胞外域（ectodomain，ECD）是一個(gè)在病毒、古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)的“古老”結(jié)構(gòu)域，為TLRs 的N 端，主要由亮氨酸富集重復(fù)片段（leucine-rich repeat，LRR）組成。在TLRs 中，N端是由22～29 個(gè)重復(fù)氨基酸殘基組成的一個(gè)疏水區(qū)，形成了與接頭蛋白（adapter protein）相互作用的結(jié)構(gòu)框架［3］。TLRs 的胞內(nèi)域包含一個(gè)Toll/白介素1 受體區(qū)域（toll/interleukin-1 receptor, TIR），是TLR 系統(tǒng)中唯一的信號傳導(dǎo)域。信號傳導(dǎo)域同時(shí)也存在于物種間保守的接頭蛋白［4］。TLR 引起的信號級聯(lián)反應(yīng)會(huì)使轉(zhuǎn)錄因子NF-κb 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，從而引起免疫因子的表達(dá)，激活下游適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

TLRs 的類型和數(shù)目在脊椎動(dòng)物中因類群的不同而不同［5］。根據(jù)病原微生物的特征結(jié)構(gòu)及類型，TLRs 識別并結(jié)合的配體可分為脂、 蛋白質(zhì)和核酸3 類（詳細(xì)見表1）。所有的TLR 配體都能引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，因此TLRs 又被稱為輔助性受體（adjuvant receptors）。

表1 Toll樣受體的配體及其來源

2 Toll樣受體的分子進(jìn)化模式研究

由于病原微生物的數(shù)量、 種類和致病性在空間和時(shí)間上存在差異，因此對免疫系統(tǒng)所施加的選擇壓力在強(qiáng)度和方向上也存在著差異［5］。一般認(rèn)為，病原體和宿主之間協(xié)同進(jìn)化關(guān)系可能符合“紅皇后效應(yīng)”（Red-Queen effect）。在環(huán)境條件穩(wěn)定時(shí)，一個(gè)物種的任何適應(yīng)性進(jìn)化都會(huì)對另一物種構(gòu)成選擇壓力，這種相互關(guān)系進(jìn)而推動(dòng)2 個(gè)系統(tǒng)共同進(jìn)化［1］。這種進(jìn)化關(guān)系一直是微進(jìn)化研究的熱點(diǎn)之一。對調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)的功能基因的適應(yīng)性進(jìn)化及其分子機(jī)理的研究，將揭示病原微生物所驅(qū)動(dòng)的選擇壓力的強(qiáng)度和方向的差異，從而進(jìn)一步闡明宿主和病原微生物之間的相互關(guān)系，豐富對免疫系統(tǒng)微進(jìn)化機(jī)制的認(rèn)識。對病原體的宿主免疫系統(tǒng)進(jìn)化的分子機(jī)理進(jìn)行研究，不僅具有重要的科學(xué)價(jià)值，同時(shí)還可以為疾病防控等應(yīng)用性研究提供理論依據(jù)［7］。

2.1 分子進(jìn)化受選擇模式的檢測 自然選擇在功能蛋白分子上留下了選擇“痕跡”，這些痕跡以突變和遺傳變異的形式保留在群體中。通過適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法檢測遺傳變異在種內(nèi)和種間的分布規(guī)律，能更好地幫助了解選擇的強(qiáng)度和方向。編碼蛋白質(zhì)的DNA 序列的適應(yīng)性進(jìn)化的檢測，主要是通過比較每個(gè)位點(diǎn)的非同義替換率（dN）與同義替換率（dS）實(shí)現(xiàn)的［8］。通常用ω=dN/dS衡量這2 種替換率的差異。如果這種氨基酸的改變是中性的，則固定的概率和同義替換固定的概率是相同的（ω=1）。如果這種改變是有害的，則負(fù)選擇（negative selection）或凈化選擇（purifying selection）將會(huì)降低它固定的頻率，甚至將其移除（ω＜1）；只有當(dāng)其受到正選擇（positive selection）時(shí)，自然選擇提供的選擇優(yōu)勢才會(huì)提高它固定的頻率（ω＞1）。

上述的檢測方法存在一定的局限性，因?yàn)樵诨蚪M中很多的功能基因普遍受到負(fù)選擇的影響而使得ω 小于1 或趨近于0，從而掩蓋了受正選擇的少數(shù)基因，例如：如果正選擇只發(fā)生在一段物種進(jìn)化的一小段時(shí)間內(nèi)，影響的只是少數(shù)位點(diǎn)，那么使用這種方法是很難檢測的［9］。此外，影響正選擇的因素有很多，種群歷史、選擇的類型包括背景選擇（background selection）和平衡選擇（balancing selection）、選擇發(fā)生的時(shí)間、位置、對象和強(qiáng)度、有利等位基因的類型、 選擇是單個(gè)發(fā)生的還是復(fù)發(fā)的都會(huì)影響推測的結(jié)果。由于任何一個(gè)因素的改變都會(huì)影響檢測結(jié)果，因此未來檢驗(yàn)分子進(jìn)化的統(tǒng)計(jì)模型將會(huì)更加復(fù)雜，檢測的靈敏度也會(huì)越來越高。上述基本概念構(gòu)成了通過分子遺傳變異檢驗(yàn)自然選擇的基本方法，也是下文討論TLRs基因家族進(jìn)化（受選擇）模式的理論依據(jù)。

2.2 脊椎動(dòng)物TLRs基因家族的進(jìn)化

2.2.1TLRs基因的進(jìn)化模式 脊椎動(dòng)物、 無脊椎動(dòng)物甚至植物的先天性免疫系統(tǒng)存在共同的特征，包括與微生物相聯(lián)系的共同受體、保守的病原體相關(guān)蛋白激酶信號級聯(lián)反應(yīng)等，這暗示著先天性免疫系統(tǒng)的起源可能相當(dāng)古老。例如，10 億年前就發(fā)生分歧的動(dòng)物和植物體內(nèi)存在同源的宿主防御通路，它們似乎共同“選擇”了介導(dǎo)先天性免疫這一功能，這是趨同進(jìn)化的結(jié)果［10］。介導(dǎo)這一套保守的防御通路分子如TLRs基因在不同的宿主中通過獨(dú)立的進(jìn)化，從而接納分子組成不同的免疫系統(tǒng)，以抵御形形色色的病原體入侵。然而，每個(gè)物種與病原體之間的免疫防御反應(yīng)是通過協(xié)同進(jìn)化構(gòu)成的。因此，TLRs基因的進(jìn)化模式應(yīng)是對物種特異性病原體及其相關(guān)分子模式的適應(yīng)。

另一方面，對于病原微生物而言，引起其結(jié)構(gòu)變化的突變是有害的。因此，為了維持其基本的生物功能，這些病原微生物的分子結(jié)構(gòu)受到限制，通常是保守的。從這個(gè)角度看，識別它們的TLRs基因同樣需要非常保守才可以維持對特異病原體的識別，因此傾向于受到負(fù)選擇的作用，即清除有害的突變。但是，仍有少數(shù)與病原體識別相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)受到正選擇［11-12］，從而積累了遺傳多態(tài)性，而這些TLRs基因的正選擇區(qū)域才是進(jìn)化生物學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。TLRs基因的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)表明，選擇壓力在TLRs基因的不同區(qū)域呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。例如，在區(qū)域水平上，TLRs信號傳導(dǎo)域TIR 域較胞外域進(jìn)化慢，這與保守的信號通路和不同病原體分子的識別有關(guān)；然而在TLR4胞內(nèi)域（C端）也發(fā)現(xiàn)了隨機(jī)分布的多態(tài)性，研究表明這是為了識別配體LPS（脂多糖）的結(jié)構(gòu)多樣性，以保證LPS 能夠整合到免疫反應(yīng)中，這種多樣性被認(rèn)為是TLR4基因?qū)PS 的敏感程度在種間的差異表現(xiàn)［13］。有些物種TLRs基因的正選擇信號全部都集中在胞外域，如家雞的TLR7基因［14］。這也說明了隨著病原微生物的進(jìn)化，TLRs也可能隨之進(jìn)行適應(yīng)性的改變。有趣的是，也有研究通過比較識別病毒和非病毒病原體的TLRs進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)前者的進(jìn)化速率較后者慢，這是因?yàn)樽R別病毒的TLRs受到更大的負(fù)選擇壓力［15］。

很多研究亦揭示了在不同的TLR基因的不同結(jié)構(gòu)區(qū)域，在高等脊椎動(dòng)物的類群間存在有不同的選擇模式。例如，集中在模式生物如家雞（Gallus gallus）、火 雞（Meleagris gallopavo）和 斑 胸草雀（Taeniopygia guttata）的鳥類TLRs 分子進(jìn)化模式的研究表明，鳥類TLRs基因主要受到負(fù)選擇，選擇模式是普遍存在的負(fù)選擇中穿插著正選擇［11］。正選擇位點(diǎn)大都位于識別配體的胞外區(qū)域，意味著這些受正選擇的區(qū)域和位點(diǎn)對每個(gè)TLRs受體的功能都非常重要，這些導(dǎo)致TLRs結(jié)構(gòu)改變的突變可能有利于受體更好地與病原體識別和結(jié)合［12］。在哺乳動(dòng)物中，TLRs基因普遍受到負(fù)選擇的作用［17］。然而研究者在對普通田鼠（Microtus arvalis）的研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因受到正選擇，這可能是該基因受到了與呼吸道疾病有關(guān)的病原體的強(qiáng)烈選擇壓力而造成的［14，18］。針對人類TLRs的研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)選擇是主要的選擇模式［19］，但是細(xì)胞表面的TLR2基因存在高危害性的非同義突變率和高終止密碼子突變率，也說明在選擇強(qiáng)度相對較小的情況下，TLR2基因存在較高的突變速率［19］。

2.2.2TLRs基因組成和功能的進(jìn)化 除了研究TLRs受選擇模式外，比較基因組學(xué)還研究了TLRs家族不同基因在脊椎動(dòng)物中的基因組成及同源性，例如，對寒武紀(jì)物種大爆發(fā)之后通過基因復(fù)制產(chǎn)生的基因（TLR1LA、TLR1LB及TLR2A、TLR2B）的研究［20］。研究表明,基因TLR1LA、TLR1LB與TLR2A、TLR2B之間旁系同源基因的相似性較直系同源的基因高，原因是在4 500 萬年和200 萬年前在大多數(shù)鳥類和哺乳動(dòng)物中發(fā)生的基因轉(zhuǎn)換（gene conversion）事件［11］。相比基因的復(fù)制，基因轉(zhuǎn)換一方面增加了TLRs家族的基因多樣性，另一方面簡化了基因組大小。尤其對鳥類而言，進(jìn)化出更小的基因組可能與其節(jié)約能量以適應(yīng)飛行有關(guān)［22］。在人類、黑猩猩、恒河猴等靈長類物種中，與TLR2基因功能基因串聯(lián)存在的還有TLR2P［13］，以此推測TLR2B/2P基因是直系同源基因。在哺乳動(dòng)物中，TLR2P基因以功能基因和假基因2 種形式同時(shí)存在，這可能是由于TLR2基因復(fù)制的每一個(gè)基因受到不同的選擇壓力，導(dǎo)致基因在功能上的分化。這和鳥類體內(nèi)的TLR1/2 受體二聚體能識別更廣泛的病原體這一預(yù)期是相符的［21］。

可以在哺乳動(dòng)物和魚類等基因組上找到家雞的6 個(gè)直系同源基因：其中，TLR2基因（包含2A、2B）是哺乳動(dòng)物的直系同源基因，TLR3、TLR4、TLR5、TLR7是其他脊椎動(dòng)物的TLR直系同源基因。TLR21基因僅在魚類中發(fā)現(xiàn)，TLR1基因（含1LA、1LB）是鳥類所特有的［23］。TLR7、TLR8、TLR9等基因在魚類和哺乳動(dòng)物均存在，其中TLR8以假基因形式出現(xiàn)，TLR9則被“移除”［23］。TLR11、TLR12、TLR13在其他少數(shù)脊椎動(dòng)物中存在，但在鳥類中已經(jīng)丟失［24］。在以非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）為代表的兩棲動(dòng)物中，TLRs 家族包括20 個(gè)基因，結(jié)構(gòu)與魚類和哺乳動(dòng)物基本相似。它們3 個(gè)類 群 共 有TLRs包 括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9等基因，與魚類相似的有TLR14、TLR21、TLR22、TLR23，與哺乳動(dòng)物相似的有TLR6、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13；此外，TLR2、TLR6、TLR8各有一個(gè)復(fù)制基因［25］。爬行動(dòng)物以安樂蜥（Anolis carolinensis）為代表［26］，發(fā)現(xiàn)并命 名 的 有TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR13、TLR15等基因，它們的結(jié)構(gòu)皆與哺乳動(dòng)物相似，其中TLR15是爬行動(dòng)物和鳥類所特有的。綜上，TLRs基因的數(shù)量在脊椎動(dòng)物不同分支類群中變化較大，呈現(xiàn)出復(fù)制和丟失并存的格局。這種數(shù)量差異可能與脊椎動(dòng)物生活方式不同有關(guān)，例如，為了在水、陸迥異的生活環(huán)境中抵御病原體，TLRs基因的數(shù)量在進(jìn)化歷史中發(fā)生了擴(kuò)張或縮小。

3 展望

近年來，對主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC） 和TLRs基因等為代表的免疫基因進(jìn)化模式的深入研究［25，27］揭示了由病原微生物介導(dǎo)的自然選擇（pathogen-mediated selection）壓力是驅(qū)動(dòng)免疫相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化的主要原因，由于免疫系統(tǒng)與野生動(dòng)物抵御疾病有關(guān)，因此這類研究也是近年來分子生態(tài)學(xué)和保護(hù)遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)問題之一。綜上所述，TLRs基因分子進(jìn)化研究的主要結(jié)論是：由于不同的選擇壓力，TLRs呈現(xiàn)出以凈化選擇（負(fù)選擇）為主導(dǎo)，同時(shí)穿插著正選擇的選擇模式。這是宿主和病原體協(xié)同進(jìn)化，或是自然選擇對免疫系統(tǒng)局部優(yōu)化的結(jié)果。而TLRs的正選擇位點(diǎn)將為疾病治療、疫苗的研發(fā)等領(lǐng)域提供重要參考［28］。未來的研究還將集中于以下幾個(gè)方面：

其一，根據(jù)已知的模式物種TLRs基因全序列設(shè)計(jì)引物，在更多的物種中檢測TLRs基因受選擇模式和位點(diǎn)，更全面地分析其進(jìn)化模式，以便研究不同類型的野生脊椎動(dòng)物類群的TLRs基因與病原微生物的協(xié)同進(jìn)化。隨著更多物種TLRs基因被測序出來，可以建立脊椎動(dòng)物TLRs基因的系統(tǒng)性數(shù)據(jù)庫，為研究TLRs基因起源及免疫系統(tǒng)的進(jìn)化提供重要的基礎(chǔ)信息。例如，英國倫敦大學(xué)皇家獸醫(yī)學(xué)院（Royal Veterinary College）已建立起胞外域LRR 數(shù)據(jù)庫（TLRRdb），共收錄了2651條獨(dú)立序列，網(wǎng)絡(luò)平臺（http://www.lrrfinder.com）可提供并執(zhí)行快速準(zhǔn)確的LRR 檢測及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，這為分析TLR基因家族的結(jié)構(gòu)及其分子進(jìn)化提供了很大的便利。

其二，TLRs在同一物種不同種群的分子進(jìn)化是近年來研究的重點(diǎn)。免疫基因常常因病原體介導(dǎo)的選擇而表現(xiàn)出相對較高的遺傳多態(tài)性。在一個(gè)種群中，雜合子的個(gè)體或比純合個(gè)體更具選擇優(yōu)勢；同時(shí)，病原體在時(shí)空上的組成變化直接影響了宿主種群水平的遺傳多樣性［5］。除了自然選擇，遺傳漂變（genetic drift）、奠基者效應(yīng)（founder effect）、種群的進(jìn)化歷史（demographic history）等進(jìn)化過程［15］都可能對TLRs多態(tài)性產(chǎn)生影響。認(rèn)識不同進(jìn)化力量對種群TLRs多樣性的塑造，需要更為詳細(xì)的群體遺傳學(xué)研究。例如：在對歐洲田鼠TLR2基因的單倍型結(jié)構(gòu)的分析中，自然選擇維持著其主要的單倍型多態(tài)性［31］；而對再次引入的瀕危物種新西蘭鴝鹟（Petroica australis rakiura）的TLRs研究中，帶有基因型TLR4be 的個(gè)體存活率更高，研究者推測該TLRs基因的單倍性在小種群里更普遍，遺傳漂變的作用對種群遺傳多樣性的影響大于自然選擇［55］。

其三，隨著第2 代高通量測序技術(shù)（Next-generation sequencing）的廣泛應(yīng)用，基因組測序和注釋、基因表達(dá)及調(diào)控、基因功能以及蛋白/核酸相互作用等方法大大推動(dòng)了對于許多非模式物種的基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究。這些物種的基因組數(shù)據(jù)形成了一個(gè)海量的數(shù)據(jù)庫集，可以通過重測序／轉(zhuǎn)錄組測序的方法獲得大量完整的TLRs基因序列，較使用單個(gè)或多個(gè)TLR基因位點(diǎn)的研究更為全面地揭示高等脊椎動(dòng)物的TLRs基因的分子進(jìn)化。例如，以喀爾巴阡蠑螈（Lissotriton montandoni）和歐洲滑螈（Lissotriton vulgaris）為研究對象，Babik等（2015）通過轉(zhuǎn)錄組測序得到整個(gè)TLR家族基因，分析發(fā)現(xiàn)TLRs的多態(tài)性的確在應(yīng)對變化的病原體帶來的壓力方面起到了重要作用，相關(guān)免疫基因多樣性和疾病抵抗力關(guān)系的證據(jù)，對那些因?yàn)轭l繁發(fā)生的疾病而瀕臨滅絕的野生動(dòng)物種群的保育具有一定的參考價(jià)值。

綜上，由于TLRs在脊椎動(dòng)物先天性免疫應(yīng)答功能上的重要作用，使TLR家族基因的遺傳變異可能與自然群體的適合度密切相關(guān)。正如前文所述，很多研究表明TLRs基因具有低水平的遺傳變異，但是在胞外的結(jié)構(gòu)域中存在著一定數(shù)量的突變位點(diǎn)，這表示TLRs基因在結(jié)構(gòu)和功能上的保守性與其應(yīng)對病原微生物變異上的靈活性存在著辯證統(tǒng)一。而TLRs受體在不同脊椎動(dòng)物類群中數(shù)量和功能的變化上的差異，很可能是受到了脊椎動(dòng)物不同類群生活方式和生活史的影響。盡管如此，人們對于TLRs進(jìn)化規(guī)律的認(rèn)知還停留在模式物種和少數(shù)的野生動(dòng)物種群上。隨著高通量測序技術(shù)大規(guī)模的應(yīng)用于非模式物種的分子進(jìn)化研究中，人們能夠使用更高效的方法獲取更多物種的TLRs基因數(shù)據(jù)集，并從中解釋這些基因在自然群體中的功能多態(tài)性和進(jìn)化規(guī)律。