鄧文嬋

摘 要 呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是引起嬰幼兒急性下呼吸道感染及免疫缺陷的常見病原，也是老年、 病弱群體中誘發(fā)免疫抑制的重要病原。本研究利用基質輔助激光解析/電離質譜（MALDIMS），對RSV 病毒感染宿主細胞的變化進行考察。結果表明，在分子量為5000～10000 Da范圍內，有3組信號峰在正常組和感染組中表達均有顯著變化，其中1個差異組分在RSV感染之后表達上調（m/z 6154.25），2個差異組分在RSV感染后表達下調（m/z 7658.47和9259.82）。本方法無需對細胞樣品進行復雜處理，采用MALDIMS證明了感染細胞與未感染細胞前后表達存在顯著差異，直接獲得細胞在病毒感染后產生的反應應答模式和細胞生理功能改變的信息，為呼吸道合胞病毒疾病診斷與病理研究提供了實驗基礎。

關鍵詞 基質輔助激光解析/電離質譜； 呼吸道合胞病毒； 疾病標志物

1 引 言

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是一種RNA病毒，是引起嬰幼兒急性下呼吸道感染的主要病毒病原，可引起間質性肺炎及毛細支氣管炎[1，2]。其感染在全球范圍都有發(fā)生，且全年均可發(fā)病，對人類健康影響較大。目前用于RSV病毒研究的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附測定[3]、 直接免疫熒光法[4]、 實時PCR技術及微陣列技術等[5]，而用質譜分析方法研究RSV病毒的報道還較少。基于蛋白組學的研究方法，建立快速識別未感染細胞與感染細胞且鑒定表達差異的有效方法，對研究RSV病毒病理和細胞生理功能改變具有重要意義?；|輔助激光解析/電離質譜（Matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDIMS）作為軟電離質譜的代表，具有靈敏度高、 分辨率高等優(yōu)勢，已在蛋白質、 多肽、 核酸等生物大分子檢測尤其是蛋白質組學、 多肽組學和質譜成像分析等研究中得到廣泛應用[6～10]。MALDIMS雖然在生物大分子檢測方面取得了成功，但在單細胞分析方面仍然有很大的應用空間，用于病毒感染細胞前后生物分子差異表達分析方面的研究較少。

本研究采用MALDIMS，對正常細胞感染RSV病毒后的細胞組分表達差異進行分析考察。利用MALDIMS高通量、 進樣量少及自動化程度高的優(yōu)勢，在不對細胞進行繁瑣、 耗時的樣品純化等操作的前提下，初步建立了快速識別未感染細胞與病毒感染細胞的方法。相比于常規(guī)細胞樣品質譜分析需要對細胞進行破碎及提取物純化等多步繁瑣操作，以及可能會造成細胞中微量樣品損失等問題，本方法可實現(xiàn)病毒感染早期細胞的快速鑒定，可提供RSV病毒病理研究最直接的實驗證據(jù)。通過對比RSV病毒感染和非感染的Hep2細胞的質譜信號變化，在排除RSV病毒自身干擾信號后，明確質譜信號是否來源于RSV病毒感染Hep2細胞，據(jù)此可實現(xiàn)RSV病毒感染細胞的快速鑒定， 為呼吸道合胞病毒疾病診斷與病理研究提供了實驗基礎。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Autoflex Speed基質輔助激光解析/電離質譜（MALDIMS，德國布魯克公司）； CKX41光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）； 5810R高速離心機（德國艾本德公司）； CO2細胞培養(yǎng)箱（力康生物科技有限公司）； QL901渦旋混勻儀（其林貝爾公司）； 80℃細胞存儲冰箱（美國賽默飛公司）。

RSV病毒（廣州博特生物科技有限公司）； Hep2上皮細胞（中南大學湘雅醫(yī)院）； 胰酶、 PBS緩沖液、 RPMI 1640培養(yǎng)基（Hyclone）、 胎牛血清（Gibco）、 支原體抗生素Mplasmocin（InvivoGen）、 硫酸鏈霉素、 青霉素G鈉、 戊二醛、 中性紅、 三氟乙酸、 乙腈（美國SigmaAldrich公司）； α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）、 2，5二羥基苯甲酸（DHB）、 芥子酸（SA）（德國布魯克公司）； 實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 培養(yǎng)基的配制 取RPMI 1640培養(yǎng)基100 mL，加入10%胎牛血清、 1%雙抗（青霉素G鈉和硫酸鏈霉素）以及0.1% 抗支原體藥，混合配制成10% 細胞培養(yǎng)基。取 RPMI 1640培養(yǎng)基100 mL，加入2%的胎牛血清以及1%的雙抗，混合配制成2% 細胞培養(yǎng)基。

2.2.2 細胞的培養(yǎng)及病毒擴增 Hep2細胞培養(yǎng)在10% RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于細胞培養(yǎng)箱中（37℃， 5% CO2）培養(yǎng)48 h。在光學顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞生長密度達到90%以上時，移去培養(yǎng)基，用5 mL PBS清洗細胞2次。然后向培養(yǎng)瓶內加入適量RSV病毒，置于細胞培養(yǎng)箱中（37℃， 5% CO2）孵育2 h，吸去RSV病毒廢液，加入13 mL 2% RPMI 1640培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中（37℃， 5% CO2）孵育48 h。在光學顯微鏡下觀察出現(xiàn)明顯的合胞時，收集培養(yǎng)瓶中的溶液至凍存管中， 80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谂囵B(yǎng)瓶中加入2 mL PBS，反復凍融3次使細胞裂解，以3000 r/min離心10 min， 收集上清液，即為獲得的RSV病毒，于 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 RSV病毒毒力測定 用胰酶消化Hep2細胞，將其用2% RPMI 1640培養(yǎng)液配成一定濃度的細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）孵育24 h。然后吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次，加入不同濃度梯度的RSV病毒，置于恒溫培養(yǎng)箱中（37℃，5% CO2）孵育7天。吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，然后每孔加入以戊二醛、 中性紅和PBS配制的混合溶液100 μL，室溫放置1天。吸掉廢液，用清水沖洗各孔，用空斑法計算所獲得病毒的毒力。endprint

3 結果與討論

3.1 不同基質對檢測的影響

考慮到在MALDIMS分析中，基質有如下作用： 吸收并轉移激光能量保護樣品； 均勻分散樣品避免分析物之間的締合； 提供質子使得樣品分子離子化[11]。因此， 應首先需確定合適的基質。如圖1所示，分別采用α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）、 2，5二羥基苯甲酸（DHB）、 芥子酸（SA）基質進行實驗發(fā)現(xiàn)，CHCA基質用于分析檢測Hep2細胞，可以得到較為全面的質譜信號，主要原因可能是相比于其它兩種基質，CHCA具有更好的激光能量轉移及質子轉移效率。

3.2 不同離子模式的影響

待測樣品被離子化后，可能攜帶正電荷或負電荷，因此不同的離子模式對檢測效果影響較大[12]。在正離子（LP）模式下，對于待測樣品離子化后產生的陽離子有較高的靈敏度； 而在負離子（LN）模式下，主要是對陰離子有響應。為了實現(xiàn)待測樣品的靈敏檢測，對不同離子模式進行了考察。如圖2所示，在負離子模式下，未檢測到待測樣品的任何信號，但是在正離子模式下，可以明顯檢測到Hep2細胞樣品的信號。這是由于CHCA基質分子中羥基、 羧基具有可解離的氫質子，在激光的轟擊作用下，解離出的質子在飛行過程中結合到待測樣品上，使得待測樣品分子結合質子帶正電，從而在正離子模式下被檢測到。所以本研究選用正離子檢測模式進行后續(xù)實驗。

3.3 不同激光能量的考察

對于MALDIMS分析，激光能量的高低直接影響信號強度的強弱。若激光能量較低，則不利于樣品的離子化，從而檢測不到樣品信號； 若激光能量較高，一方面強的激光能量會破壞待測樣品，使得質譜信號變得復雜，進而增加分析難度，另一方面強的激光能量會對激光器造成損傷，縮減其使用壽命。因此在保證不損傷激光器的前提下，選擇適當?shù)募す饽芰繉悠方馕鲭婋x至關重要。如圖3所示，70%的激光能量時，得到的信號強度高，信噪比好，因此本研究選擇70%的激光能量進行后續(xù)實驗。

3.4 RSV病毒感染Hep2細胞的MALDIMS分析

Calderaro等[13]對Intestine 407細胞受RSV病毒感染前后的差異進行研究，發(fā)現(xiàn)有3個組分有明顯差異表達。為了實現(xiàn)對RSV病毒的更全面分析，對RSV病毒感染Hep2細胞進行研究。為了獲得較為準確的Hep2細胞受RSV病毒感染前后的質譜數(shù)據(jù)，且排除RSV病毒自身信號干擾，在上述優(yōu)化的條件下，首先對單獨RSV病毒的MALDIMS信號做了考察。如圖4A所示，單獨RSV病毒的質譜信號主要在m/z 4284.56、 4966.25、 8559.17和11607.49處出現(xiàn)質譜峰。繼而通過MALDIMS質譜對病毒感染前后Hep2細胞進行考察。如圖4B所示，通過對Hep2細胞感染RSV病毒前后的MALDIMS質譜圖的比較，發(fā)現(xiàn)在m/z 6154.25、 7658.74及9259.82處質譜信號發(fā)生明顯變化，其中m/z 6154.25的差異組分在RSV感染之后表達上調，m/z 7658.47和9259.82的差異組分在RSV感染后表達下調。有文獻報道，RSV病毒感染Hep2細胞后白細胞介素6和白細胞介素8的表達存在顯著差異[14]，此外RSV病毒感染所引起的炎性反應和免疫反應亦與肺泡表面活性物質的變化有關[15]，因此上述結果在篩選與RSV病毒診斷有關的生物標志物方面具有參考意義，同時也說明病毒感染和致病可能是由病毒因素和宿主細胞因素兩方面相互作用的結果。上述實驗結果還有待深入研究。

4 結 論

本研究利用MALDIMS高通量、 分析速度快及高靈敏等的優(yōu)勢，在不對細胞樣品進行純化處理的前提下，實現(xiàn)了對細胞的檢測，初步建立了未感染細胞與RSV病毒感染細胞的鑒定方法。通過質譜分析技術，對正常Hep2細胞和RSV病毒感染的Hep2細胞進行比較，結果表明，被RSV病毒感染后某些組分的表達發(fā)生明顯變化，其中組分m/z 6154.25發(fā)生上調，m/z 7658.74和9259.82發(fā)生下調。該差異表達可能來自兩個方面，一方面是在病毒感染后，Hep2細胞自身代謝引起的組分變化，從而有助于Hep2細胞的進一步研究； 另一方面是RSV病毒自身作用引起的組分變化，有助于對RSV病毒的研究。本研究結果表明，MALDIMS技術在呼吸道合胞病毒疾病診斷與病理研究中有良好的應用潛能。

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Abstract Respiratory syncytial virus （RSV）， which is a major cause of lower respiratory tract infections during infancy and childhood， is also an important pathogen for immunosuppression in elder and diseased areas. In order to research the pathogenesis of RSV， the matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry （MALDIMS）was used to explore the difference between uninfected cells and virusinfected cells. The result showed that， in the molecular weight range of 5000～10000 Da， there are three component peaks expressed with significant difference in both normal group and infection group. One of the three components was upregulated （m/z 6154.25） and the other two were downregulated （m/z 7658.47 and 9259.82） after RSV infection. This result proved the obvious differences between the infected cells and untreated cells.The differential expression may provide a feasible method for RSV disease diagnosis and pathology research， and also provide scientific evidences for research on development of RSV therapeutic drugs.

Keywords Matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry； Respiratory syncytial virus； Biomarker

（Received 16 June 2017； accepted 12 December 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21535006）.endprint