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        生肌象皮膏對糖尿病潰瘍大鼠Ang/Tie-2通路的影響*

        2018-03-02 07:25:01朱子昭李巧芬
        天津中醫(yī)藥 2018年2期
        關(guān)鍵詞:糖尿病實驗

        劉 鵬 ,朱子昭 ,常 柏 ,李巧芬

        (1.天津中醫(yī)藥大學,天津 300193;2.天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院,天津 300050)

        糖尿病在中國的患病率快速增長,成年人患病率已達11.6%,更嚴重的是中國約有45%的糖尿病患者未被診斷[1]。糖尿病對患者生命及生活質(zhì)量最大的威脅來自其并發(fā)癥。長期高血糖可導致大血管及微血管動脈粥樣硬化,伴有下肢血管病變的患者如果發(fā)生急、慢性損傷出現(xiàn)皮膚破潰,則會引發(fā)糖尿病足病,這是糖尿病患者住院率最高的疾病。糖尿病足的主要治療手段為清創(chuàng)、控制感染、改善局部血液循環(huán),必要時需截肢[2],糖尿病難愈性潰瘍的修復(fù)是困擾臨床醫(yī)生乃至整個內(nèi)分泌界的難題。中國傳統(tǒng)醫(yī)學中具有生肌長皮作用的外用藥多種多樣,生肌象皮膏是其中代表之一,目前多用于治療各種感染傷口、慢性潰瘍及糖尿病足[3]。本課題組既往的研究已經(jīng)證明,生肌象皮膏可以加速糖尿病大鼠難治性潰瘍創(chuàng)面的愈合;可以增加表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶的含量;增加早期纖維連接蛋白的含量;能增加胰島素樣生長因子-1受體的表達。生肌象皮膏可以在一定程度上抑制終末糖基化產(chǎn)物及受體的產(chǎn)生,隨時間的延長,更為明顯,促進糖尿病潰瘍的愈合[4-7],對治療糖尿病難治性潰瘍有著良好的臨床效果[8]。本實驗旨在通過對酪氨酸激酶受體-2(Tie-2),血管緊張素Ⅰ(Ang-1)及血管緊張素Ⅱ(Ang-2)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)觀察,進一步揭示生肌象皮膏促進糖尿病潰瘍愈合的可能機制。

        1 實驗材料

        1.1 實驗動物 健康SD大鼠,雄性,清潔級,28日齡,體質(zhì)量(102.83±4.10)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限責任公司。

        1.2 實驗試劑 生肌象皮膏、凡士林、氯仿、異丙醇、無水乙醇均購自天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室;鏈脲佐菌素(STZ),產(chǎn)自美國Sigma公司;超純RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)試劑盒、5x RNA Loading Buffer,均產(chǎn)自TaKaRa公司。Real-Time PCR檢測目的基因引物,見表1。

        1.3 實驗儀器 羅氏血糖儀及試紙條,產(chǎn)自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司;3K30型高速臺式冷凍離心機,產(chǎn)自美國Sigma公司;Bio Tek Synergy2多功能酶標儀,產(chǎn)自美國Bio-Te K公司;Bio-Rad電泳儀,產(chǎn)自美國Bio-Rad公司。

        表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

        2 實驗方法

        2.1 造模及分組 健康SD大鼠120只,均為雄性,在適應(yīng)性常規(guī)飼料喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量、血糖分層,隨機分為2組,分別為空白對照組20只,糖尿病組100只。糖尿病組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)8周,經(jīng)尾靜脈注射小劑量STZ的方法制備糖尿病模型,剔除糖尿病大鼠造模過程中死亡及未成模的大鼠。1周后經(jīng)過尾靜脈注射苯巴比妥麻醉,在背部后側(cè)用打孔器打直徑為2.5 cm的孔,深度傷及筋膜層,并及時止血及無菌紗布包扎,以制備潰瘍模型,剔除死亡及未成模大鼠。剩余隨機分為:生肌象皮膏組、凡士林組、糖尿病對照組3個糖尿病潰瘍模型組,每組各32只。

        2.2 給藥 造模完成后用單籠飼養(yǎng)每組大鼠,自由飲水,常規(guī)飼料進食。每日清晨祛除硬痂,常規(guī)消毒,用生理鹽水沖洗創(chuàng)面后換藥布1次。生肌象皮膏組用生肌象皮膏紗條外敷,凡士林組用凡士林紗條外敷,空白對照組及糖尿病對照組以生理鹽水紗條外敷。4組動物創(chuàng)面均外用無菌紗布包扎,固定。

        2.3 取材 剔除死亡及未成模大鼠,每組分別于造模成功后 1、3、7、14、21 d 處死部分大鼠,采用股動脈取血及手術(shù)取新鮮創(chuàng)面肉芽組織,用液氮分別冷藏各時間點樣本,保存?zhèn)溆?。造模成功主實驗完成各組死亡大鼠數(shù)量分別為生肌象皮膏組10只,凡士林組9只,糖尿病對照組10只,故最終納入生肌象皮膏組22只,凡士林組23只,糖尿病對照組22只。

        2.4 檢測 用SYBR GreenⅠReal-Time PCR方法檢測各組潰瘍組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。用超純RNA提取試劑提取組織樣本中總RNA,并進行RNA質(zhì)量檢測,核酸在260 nm附近有強吸收,蛋白質(zhì)在280 nm附近有強吸收,利用此性質(zhì)使用Nanodrop2000超微量分光光度計測定RNA的A260/A280的比值,理想的RNA純度A260/A280應(yīng)在 1.9~2.1 范圍之間。取 5 μL RNA 用 1%瓊脂糖凝膠進行電泳,以檢測RNA的完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理后進行反轉(zhuǎn)錄。用ABI 7500型熒光定量PCR儀,根據(jù)Real-Time PCR原始檢測結(jié)果,按照 2-ΔΔCt相對定量計算公式,即 F=2-{[待測組目的基因平均Ct值-待測組管家基因平均Ct值]-[對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值]},計算出各樣本的目的基因相對定量結(jié)果。

        2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示;組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異統(tǒng)計學意義。

        3 實驗結(jié)果

        于造模成功后 1、3、7、14、21 d 提取出的各組糖尿病大鼠潰瘍組織中Ang-1、Tie-2 mRNA水平均顯著低于空白對照組(P<0.05),且生肌象皮膏組大鼠潰瘍組織中Ang-1、Tie-2 mRNA水平明顯高于凡士林組及糖尿病對照組(P<0.05),結(jié)果見表 2、3。各糖尿病模型組中Ang-2 mRNA水平明顯高于空白對照組(P<0.05),且生肌象皮膏組 Ang-2 mRNA水平明顯低于糖尿病對照組(P<0.05),結(jié)果見表4。

        4 討論

        外傷潰瘍屬于中醫(yī)中的瘡瘍,創(chuàng)面膿液的多少在一定程度上影響了潰瘍愈合的速度[9],此為“偎膿長肉”理論的概要。中醫(yī)治療的代表方為出自《瘍科綱要》的生肌象皮膏,其組成包括由象皮粉、當歸、血余炭、龜板、生地、生爐甘石、生石膏、香油及白蠟。主藥為象皮,陳寶元等[10-12]對比含有及不含有象皮的兩種生肌膏在抗炎及免疫調(diào)節(jié)方面的藥理作用,考察了象皮在組方中的作用和地位。其研究結(jié)果顯示,含有象皮的組方與無象皮的組方在臨床療效方面有明顯的差別,表明象皮在生肌象皮膏中有其獨特的作用和地位。孫玉芝等[13]研究發(fā)現(xiàn),血余炭能較顯著增強血小板聚集作用,血余炭粗晶可進促內(nèi)源性系統(tǒng)凝血,其止血原理與血漿中cAMP含量有關(guān),并能降低血小板內(nèi)環(huán)核苷酸含量,有一定的抗炎、抗菌作用。爐甘石收濕止癢斂瘡,可吸收創(chuàng)面分泌物,周靈君等[14]研究發(fā)現(xiàn)爐甘石通過改善創(chuàng)面的血液循環(huán)、加速創(chuàng)面的新陳代謝、促進傷口成纖維細胞和毛細血管的形成,加快肉芽組織增生等方面的作用,加速皮膚創(chuàng)口的愈合。煅石膏收濕止血、生肌斂瘡,李祥等[15]對照煅石膏與生石膏的生肌藥效發(fā)現(xiàn),煅石膏治療組與生石膏治療組比較,大鼠創(chuàng)口成纖維細胞數(shù)、肉芽組織中毛細血管數(shù)和肉芽組織中毛細血管面積均顯著增加,表明煅石膏能夠促進大鼠傷口成纖維細胞和毛細血管的形成,加快肉芽組織增生,從而加速皮膚創(chuàng)口的愈合。再配伍當歸、生地、龜板三藥濡養(yǎng)受損皮膚,養(yǎng)血生津,生肌長皮。

        表2 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Ang-1 mRNA水平比較(x±s)Tab.2 Comparison of the level of Ang-1 mRNA in granulation tissue of rats in each group(x±s)μg/L

        表3 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Ang-2 mRNA水平比較(x±s)Tab.3 Comparison of the level of Ang-2 mRNA in granulation tissue of rats in each group(x±s) μg/L

        表4 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Tie-2 mRNA水平比較(x±s)Tab.4 Comparison of the level of Tie-2 mRNA in granulation tissue of rats in each group(x±s) μg/L

        在高糖條件下,炎癥反應(yīng)低下且呈階段性延長、新生血管生長緩慢、基質(zhì)蛋白水解酶呈高水平狀態(tài)、膠原合成減少、肉芽組織形成變慢等[16-17]。新生血管網(wǎng)的形成是創(chuàng)面修復(fù)的中心環(huán)節(jié)[18],只有形成豐富的新生血管網(wǎng),才能為組織修復(fù)提供所必須的氧及其他營養(yǎng)物質(zhì),從而促進創(chuàng)面微循環(huán),加速創(chuàng)面愈合。

        本次實驗的結(jié)果與既往研究觀點相一致,實驗結(jié)果提示糖尿病皮膚潰瘍愈合困難可能與創(chuàng)面局部Ang-2表達水平持續(xù)升高及Ang-1、Tie-2表達水平下降有關(guān)。生肌象皮膏可抑制糖尿病創(chuàng)面肉芽組織中Ang-2的表達,可能通過上調(diào)創(chuàng)面肉芽組織中Ang-1、Tie-2的表達水平,下調(diào)Ang-2的表達水平促進糖尿病潰瘍面的愈合。Ang/Tie-2信號通路與血管生成密切相關(guān),其中Ang-1能夠促進新生血管內(nèi)皮細胞存活并維定狀態(tài)。同時,Ang-2通過介導血管去穩(wěn)態(tài)化,拮抗Ang-1的作用靶點,從而抑制血管生成、成熟與存活[19]。升高的Ang-2一方面導致炎癥過程延長,另一方面拮抗Ang-1的作用,導致新生毛細血管成熟障礙、滲透性增加、創(chuàng)面愈合慢。

        酪氨酸蛋白激酶受體-2(Tie-2)作為 Ang-1 和Ang-2的共同受體,Ang-1與其結(jié)合后,能夠促進血管重塑以及新生血管的成熟,并進一步維持血管內(nèi)皮的完整性[20]。另外,Ang-1/Tie-2還能夠通過阻止血管內(nèi)皮細胞生長因子缺乏而發(fā)生的凋亡。在內(nèi)皮細胞中,Ang-2可競爭性地抑制Ang-1引起的Tie-2磷酸化,抑制血管周圍細胞的積聚,并拮抗Ang-1對內(nèi)皮細胞的趨化作用。本實驗發(fā)現(xiàn),生肌象皮膏組Tie-2表達水平升高,提示生肌象皮膏可能通過促進Tie-2的表達、增加Ang-1的受體數(shù)量,進而增加創(chuàng)面肉芽組織中新生毛細血管的建立、成熟及穩(wěn)定,以此保證肉芽組織的血供,促進潰瘍面的愈合。

        本實驗以糖尿病潰瘍動物模型為載體,從Ang/Tie-2通路表達促進血管新生角度探討生肌象皮膏促進糖尿病潰瘍愈合的可能作用機制,同時也為中醫(yī)“偎膿長肉”理論提供科學依據(jù)。

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