陳汝琪，呂美影，馬超

（廣東石油化工學(xué)院生物工程系，廣東茂名 525000）

我國(guó)是世界第一大柑橘生產(chǎn)國(guó)，2009年柑橘栽培面積已超過(guò)215.2萬(wàn)公頃，總產(chǎn)量達(dá)到256萬(wàn)噸[1]。目前，影響柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展最重大的問(wèn)題是柑橘黃龍病，在我國(guó)大部分的柑橘種植地區(qū)，黃龍病的危害情況已不容樂(lè)觀。目前認(rèn)為，黃龍病是由難以人工培養(yǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌引起，其寄生于柑橘枝條韌皮部，屬于α-變形菌綱的候選韌皮桿菌屬，該病菌的寄主范圍廣泛，主要寄生于柑橘屬以及草本非蕓香科植物[2]。

柑橘植株感染黃龍病后，有一定時(shí)間段的潛伏期。發(fā)病早期，葉片出現(xiàn)斑駁黃化、黃梢和不轉(zhuǎn)綠等癥狀，如圖1所示。同其他植物體一樣，柑橘組織器官內(nèi)也存在著豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源，通過(guò)從橘品種中分離出內(nèi)生細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)了多種具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌[3]，分離及篩選能夠抵抗柑橘黃龍病的內(nèi)生細(xì)菌是減少黃龍病對(duì)柑橘果樹(shù)的危害的一條有效途徑。

圖1 患黃龍病柑橘葉片

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

患黃龍病柑橘葉片，來(lái)自信宜市鄉(xiāng)鎮(zhèn)的柑橘果園；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），AR；引物OI1/OI2由上海生物工程公司合成。

1.2 儀器

Box F3型凝膠成像系統(tǒng)；ABIVeriti96型基因擴(kuò)增儀；BSP型生化培養(yǎng)箱；D3024R型臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)。

1.3 柑橘內(nèi)生菌的分離純化

柑橘內(nèi)生細(xì)菌的分離參照梁盛年等[4]的方法，略作修改。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌的分類(lèi)鑒定

挑取純培養(yǎng)的內(nèi)生菌制片，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察內(nèi)生菌的菌落形態(tài)。

1.5 柑橘內(nèi)生菌DNA的提取及PCR鑒定

將分離純化后的內(nèi)生細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上，搖床37℃擴(kuò)大培養(yǎng)16～18 h。隨后用菌液提取內(nèi)生菌DNA。

柑橘內(nèi)生菌DNA的提取參考劉小勇等[5]的方法，略作修改。

內(nèi)生菌16SrDNA的PCR擴(kuò)增選用細(xì)菌通用引物：正向引物799F和反向引物1492R，序列如下：

799F：5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'

1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'

PCR擴(kuò)增體系為25 μL，即10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，上、下游引物各 2 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 μL，DNA 模板 2 μL，MgCl21.5 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃、3 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃、7 min。PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后于凝膠成像儀中觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面消毒效果

將空白培養(yǎng)基平板和涂布了柑橘葉片最后一次無(wú)菌水沖洗液的培養(yǎng)基平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱上培養(yǎng)24 h后，細(xì)菌顯微照片如圖2所示。

圖2 細(xì)菌顯微照片

從圖1可見(jiàn)，兩種培養(yǎng)基平板上均無(wú)雜菌生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基滅菌徹底且葉片表面消毒完全，表明所分離到的細(xì)菌為柑橘葉片的內(nèi)生細(xì)菌。

2.2 柑橘植株內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果

從柑橘葉片中分離到的內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)平板劃線分離結(jié)果如圖3所示，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢如圖4所示，柑橘植株內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3 內(nèi)生菌純化結(jié)果

圖4 內(nèi)生菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

從結(jié)果可知，從柑橘葉片內(nèi)分離到的內(nèi)生細(xì)菌均為桿狀革蘭氏陽(yáng)性菌。不同品種的患黃龍病柑橘植株葉片可分離出不同種類(lèi)的內(nèi)生細(xì)菌，而且內(nèi)生細(xì)菌在不同品種的患黃龍病柑橘植株葉片中出現(xiàn)的頻次也不盡相同，這可能是由內(nèi)生細(xì)菌對(duì)不同柑橘植株的適應(yīng)性的差異引起的。

表1柑橘植株內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果

2.3 柑橘內(nèi)生細(xì)菌DNA提取結(jié)果

柑橘內(nèi)生細(xì)菌DNA提取的電泳結(jié)果如圖5所示。

圖5 柑橘內(nèi)生細(xì)菌DNA的提取結(jié)果

成功將柑橘內(nèi)生細(xì)菌的DNA提取出來(lái)，2號(hào)點(diǎn)樣空有白色亮斑出現(xiàn)，說(shuō)明可能含有RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)存在，說(shuō)明此方法提取內(nèi)生細(xì)菌的DNA可能含有多糖和酚類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)可能會(huì)對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果造成影響，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。

2.4 柑橘內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA的PCR檢測(cè)

柑橘內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA的PCR檢測(cè)的電泳結(jié)果如圖6所示。

圖6 柑橘內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA的PCR檢測(cè)結(jié)果

柑橘內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出條帶，但由于柑橘內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA在提取時(shí)濃度不高，條帶較不清晰。且經(jīng)過(guò)多次平行PCR測(cè)試證明，柑橘內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA均能擴(kuò)增出條帶，且PCR擴(kuò)增效率較穩(wěn)定，擴(kuò)增片段送至上海生物工程公司測(cè)序，經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)和內(nèi)生細(xì)菌多樣性分子鑒定結(jié)果可知，分離出的4種內(nèi)生細(xì)菌均為芽孢桿菌屬，且感染柑橘植株內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)與無(wú)癥柑橘植株的種類(lèi)存在明顯的差異。

3 結(jié)論

內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)普遍存在，其種類(lèi)和數(shù)量常與植物生長(zhǎng)年限及其所處的環(huán)境因素有一定的關(guān)系，而且本研究由于采樣數(shù)量和采樣地點(diǎn)有限，因此所分離的內(nèi)生細(xì)菌的種類(lèi)受到了一定的限制。采用常規(guī)方法獲得的優(yōu)勢(shì)屬為芽孢桿菌。且因?qū)嶒?yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，因采集樣品的季節(jié)不同，得到的菌種有所不同。除了個(gè)例，目前還沒(méi)有成功分離培養(yǎng)柑橘黃龍病病原菌的報(bào)道。

柑橘黃龍病對(duì)我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失不可估量，所以分離純化出柑橘黃龍病病原菌的拮抗內(nèi)生菌，對(duì)拯救我國(guó)乃至世界柑橘產(chǎn)業(yè)來(lái)說(shuō)急不可待。

[1]鄧烈,周常勇.世界柑橘產(chǎn)銷(xiāo)現(xiàn)狀與趨勢(shì)[J].柑桔與亞熱帶果樹(shù)信息,2005,21(1):1-4.

[2]Bové J M.Huanglongbing: a Destructive,Newly-emerging,Centuryold Disease of Citrus[J].Journal of Plant Pathology,2006,88(1):7-37.

[3]羅永蘭,張志元,喻珺.柑橘內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,45(6):773-775.

[4]梁盛年,李充璧.肇慶地區(qū)柑橘內(nèi)生細(xì)菌的分離及初步鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(35):12510-12512.

[5]劉小勇,田素忠,秦國(guó)夫,等.提取植物和微生物DNA的SDSCTAB改進(jìn)法[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1997,19(3):100-103.