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        人腫瘤抑制因子folliculin的N端結構原核表達純化

        2018-03-01 11:58:15皮業(yè)勤吳哲俊申一凡陳婷陸昌瑞張云龍
        生物化工 2018年1期
        關鍵詞:融合結構

        皮業(yè)勤,吳哲俊,申一凡,陳婷,陸昌瑞,張云龍

        (東華大學 生物科學與技術研究所,上海 201620)

        Birt-Hogg-Dube′(BHD)綜合征是一種常染色體顯性遺傳性疾病,1970年由Birt、Hogg和Dube三位加拿大醫(yī)生發(fā)現,臨床表現主要包括良性毛囊瘤、腎囊腫和腎腫瘤等[1-3]。直至2001年,對大量BHD綜合征患者遺傳連鎖分析才發(fā)現其致病與BHD基因(又稱FLCN基因)缺失或突變相關[4]。Nickerson,M.L.等探查了BHD綜合征患者的嫌色細胞腎癌與FLCN二次突變相關,暗示了FLCN是一個腫瘤抑制基因[5];隨后對裸鼠皮下注射FLCN缺陷細胞株長出腫瘤和注射轉染野生型FLCN后顯著降低腫瘤發(fā)生率對比,證明了FLCN的腫瘤抑制功能[6-7]。這些研究確定了FLCN是一種腫瘤抑制因子,但其與BHD綜合征的致病關聯(lián)尚未明確。

        FLCN基因位于常染色體17p11.2,編碼579個氨基酸的64kDa蛋白[8]。BLAST氨基酸序列比對發(fā)現,FLCN與現已知蛋白都沒有顯著同源性[9],但其在單細胞生物(酵母)到哺乳動物(咧齒類動物、犬類和人類)具有高度保守性[10],表明FLCN是一種關鍵的細胞調控因子。目前,FLCN的結構與功能研究仍處于模糊階段。2012年,Nookala R.K.等利用X射線衍射技術解析了FLCN C端341-566氨基酸區(qū)段(FLCN-CT)三維結構,經結構比對發(fā)現其與DENN1B的DENN結構域相似,推測FLCN-CT具有鳥苷酸交換因子(GEF)功能[11],但這并不能解釋FLCN突變或缺失導致BHD綜合征的致病機理。筆者對FLCN二級結構預測發(fā)現,其1-360aa.區(qū)段多為無序結構,無序區(qū)域由于構象多變而發(fā)揮重要的生物學功能[12]。FLCN基因進化分析發(fā)現它是一個進化上非常保守的基因,特別是100-230aa.這段序列[11],說明FLCN的N端具有很重要的功能。

        筆者使用的載體ppSUMO是pET28a改造而來的,表達的SUMO蛋白有助融合蛋白的高表達和溶解性[13]。在成功構建ppSUMO-N362重組質粒后,經表達純化N362融合蛋白后切去標簽,可獲得純度80%的N362蛋白。生物信息學分析發(fā)現N端多無序區(qū)域且保守區(qū)域100-230aa.有強疏水性,極易形成疏水性片段,推測其可能作為FLCN形成聚合體或轉運結合的區(qū)域。總之,這些研究將為進一步FLCN結構與功能研究奠定了基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        質粒ppSUMO、pET28a-FLCN由本實驗室保存,E.coli DH5α、E.coli BL21購自生工生物工程(上海)股份有限公司;Phusion DNA聚合酶和ULP1酶、質粒小量提取試劑盒購自Thermo Scientific公司,限制性內切酶 BamHI、XhoI和T4連接酶購自NEB公司;HRP-labeled 6×His 單抗購自Proteintech公司;Ni-NTA Agarose和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自QIAGEN公司,HiTrap Q FF 1mL強陰離子預裝柱購自美國GE公司,超濾管購自MERCK公司,其他無機鹽試劑均為國產分析純。高壓細胞破碎儀JNBIOJN-3000,蛋白純化層析儀SCG p100。

        1.2 FLCN的二級結構預測

        在psipred網站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)上輸入人源FLCN的氨基酸序列可得到FLCN二級結構無序性的預測,它是基于DISOPRED3版本的預測結果。在expasy網站(https://web.expasy.org/protscale/)上輸入人源FLCN的氨基酸序列可得到其氨基酸親疏水性的預測結果。

        1.3 ppSUMO-N362重組質粒的構建

        以pET28a-FLCN為PCR模板設計引物,N362 F:5'- ATACAT GGATCC AAT GCC ATT GTT GCC CTG TGTC -3',N362 R:5'- ATACAT CTCGAG TTA ACG AAA ACT CGG TGC GC -3'(劃線部分為酶切位點)。用常規(guī)PCR程序進行擴增。對載體和PCR產物進行5'BamH I和3'XhoI雙酶切,切膠回收后用T4連接酶16℃連接過夜;連接產物轉化至E.coil DH5α感受態(tài)細胞,搖菌抽提質粒電泳檢測,條帶正確的送生工測序鑒定。

        1.4 N362融合蛋白表達并親和純化

        將測序正確的重組質粒轉化至E.coli BL21感受態(tài)細胞中,涂布平板后挑取單克隆過夜培養(yǎng)。次日將菌液加到1L的TB培養(yǎng)基中37℃ 225r/min培養(yǎng)至OD6000.6左右,加入終濃度0.1mmol/LIPTG誘導劑16℃過夜表達。

        對表達好的菌液進行3500r/min 4℃離心30 min,棄上清后在冰上加入20mL bind buffer(25mmol/LNa2HPO4pH 8.0,500 mmol/L NaCl,10mmol/L咪唑)重懸菌沉,加入終濃度1mmol/LDMSF蛋白酶抑制劑,用高壓細胞破碎機在4~6℃下1×105~1.5×105kPa破碎細胞兩三次后,12 000 r/min 4℃離心1h。將上清加入預先用Bind Buffer(25 mmol/LNa2HPO4pH8.0,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑)處理的Ni-NTA親和層析柱中,重復結合兩次后,加入大量的Wash buffer(25 mmol/LNa2HPO4pH8.0,500 mmol/LNaCl,20 mmol/L咪唑)洗滌,雜蛋白洗去后用Elute buffer(25 mmol/L Na2HPO4pH 8.0,500 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白;將洗脫液用30 kD超濾管濃縮保存。各組分用12%SDS-PAGE和Western blot進行檢測。

        1.5 N362融合蛋白離子交換純化

        N362融合蛋白的預測等電點是5.7,選用GE的HiTrap Q FF 1mL強陰離子預裝柱,用SCGp100蛋白純化層析系統(tǒng)來進行純化。先用5CV BufferB(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液pH8.0,500 mmol/L NaCl)清洗柱子后,再用10CV Buffer A(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液pH8.0)平衡柱子,設置程序:用Buffer A和 Buffer B設置從0到500 mmol/L NaCl鹽濃度梯度,共收集45mL,設置流速1mL/min,警報壓力0.3 MPa,每管收集1mL。進樣后開始程序,收集洗脫峰流出的樣,用12% SDS-PAGE跑膠鑒定后將純度高的目的蛋白用30kD超濾濃縮管濃縮保存。

        1.6 用ULP1酶對融合蛋白酶切

        將純化好的融合蛋白和1 μLULP1酶加入到bufferA(50 mmol/LTris-HCl,pH 8.0,1 mmol/LDTT)定容至5mL,4℃條件下靜止酶切過夜。將酶切好的蛋白溶液轉移到平衡好的Ni-NTA親和層析柱中,二次過柱收集穿出液。將穿出液用10kD超濾濃縮管濃縮保存。

        2 結果與討論

        2.1 FLCN二級結構預測顯示N端多無序區(qū)域

        在psipred網站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)上預測得到人源FLCN二級結構的無序區(qū)域如圖1a所示,其中橫坐標表示FLCN一級結構氨基酸的排列順序,縱坐標表示蛋白無序性的可信度打分,可信度高于0.5即當藍線高于灰色虛線時,對應的氨基酸被認為是無序的;橙色線顯示無序蛋白質結合殘基預測的可信度。從圖中可以看到,FLCN的無序區(qū)段主要是在1-360 aa.即研究的N端,并且打分很高即可信度很高,具有很高的研究價值。

        在expasy網站(https://web.expasy.org/protscale/)上預測人源FLCN的氨基酸親疏水性的結果如圖1b所示,其中橫坐標表示FLCN一級結構氨基酸的排列順序,縱坐標表示蛋白親疏水性的可信度打分,正值表示疏水,負值表示親水;可以看到FLCN的N端保守性區(qū)域100-230 aa.主要是正值且打分很好,說明有強疏水性即極易形成疏水性片段,推測可能作為FLCN形成聚合體或轉運結合的區(qū)域。

        圖1 FLCN二級結構預測

        2.2 ppSUMO-N362重組質粒構建

        將擴增后的N362片段插入ppSUMO載體構建重組質粒ppSUMO-N362,將構建好的質粒與ppSUMO載體進行電泳,檢查的結果如圖2所示,測序結果顯示構建成功且無突變。

        圖2 ppSUMO-N362的克隆鑒定

        2.3 (His)6-SUMO-N362融合蛋白鎳柱親和純化

        對表達菌進行誘導培養(yǎng)可以獲得大量融合蛋白,經高壓破碎細胞后融合蛋白大部分可融,經鎳柱純化時用大量的Wash Buffer漂洗后能將大部分雜蛋白洗去,洗脫的目的蛋白純度可高達70%;Western Blot檢查顯示重組蛋白成功表達并且很少降解(圖3上側)。

        圖3 (His)6-SUMO-N362融合蛋白表達純化

        2.4 (His)6-SUMO-N362融合蛋白離子交換后酶切

        經鎳親和純化后的融合蛋白純度不是很高,所以嘗試用HiTrap Q FF 1mL強陰離子預裝柱來純化融合蛋白,如圖4所示,當升高洗脫液的鹽濃度至300mmol/L NaCl時開始出峰,收集出峰處的洗脫液進行濃縮保存。用ULP1酶對濃縮蛋白低溫過夜酶切,可以將絕大部分的重組蛋白切開,二次過柱后穿出的濃縮樣純度可達到80%(如圖4)。

        圖4 (His)6-SUMO-N362融合蛋白的分子篩純化

        3 結論

        本實驗利用pET28a改造而來的ppSUMO載體來構建ppSUMO-N362重組質粒,融合蛋白的表達量和可溶性都很高,經鎳柱一步純化后獲得純度高達70%,使用強陰離子Q柱進行純化的效果沒有很好,接下來用ULP1酶切,可以將絕大部分的重組蛋白切開,二次過柱后穿出的濃縮樣純度達到80%,目前對于FLCN及其N端蛋白的結構還沒有具體研究報道,純化的FLCN N端片段為后期結構研究提供基礎。

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