李乾,張忠旗,郭添,王萬科,楊小琳,趙金禮
(陜西慧康生物科技有限責任公司,陜西西安 710054)
棕櫚酰四肽-7(Palmitoyl Tetrapeptide-7)又稱為棕櫚酰四肽-3,其氨基酸序列為Pal-Gly-Gln-Pro-Arg,縮寫為Pal-GQPR,屬于信號類勝肽中棕櫚酰寡肽系列多肽中的一種。
傳統(tǒng)化妝品中的功能性原料主要由無機化學合成或植物萃取提取,而近些年來,化妝品中的主要成分逐漸發(fā)展為生物基因技術(shù)產(chǎn)物[1]。20世紀90年代左右,以天然膠原蛋白質(zhì)為主的化妝品一度備受追捧,但事實上人皮膚所具有的生理化學屏障尤其是角質(zhì)層會將這些高分子的成分阻擋在外,基本無法透過表皮發(fā)揮進一步的作用,讓這一類成分淪為炒作的概念。后來又引入了蛋白質(zhì)碎片概念,指將蛋白質(zhì)通過水解和發(fā)酵等辦法分解為大量雜短肽,而由于這類多肽片段和肽序無法針對選擇,成分不單一,因此僅可用于一般保濕和修復。這類多肽混合物并不是嚴格意義的美容勝肽[2]。
真正意義的美容勝肽需同時具備以下特點:(1)特定的氨基酸序列和分子量,目前常見美容勝肽為2~10個氨基酸縮合物;(2)機理清晰,明確作用于皮膚某個微觀受體;(3)添加量少;(3)來源大都為化學合成。這類小分子寡肽,具有無毒、高生物活性、特定的生化生理機制、同源性且易吸收的特點,從本質(zhì)上解決各類皮膚問題,而備受化妝品行業(yè)的關(guān)注。棕櫚酰系列多肽更是其中的佼佼者。
棕櫚酰系列多肽屬于信號類勝肽,能夠促進基質(zhì)蛋白(matrix protein)尤其是膠原蛋白的合成,同時還可能促進彈性蛋白、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖和纖維連接蛋白等多種蛋白的生成。棕櫚酰肽通過增加基質(zhì)細胞的活動來促進膠原蛋白的合成,增加皮膚彈性和更顯年輕。類似傳統(tǒng)的抗皺原料,如維生素C、維生素A的衍生物,但促進膠原蛋白生成的能力遠勝于維生素C和維生素A視黃醇。
目前,國際上關(guān)于棕櫚酰五肽-3和棕櫚酰三肽-1的合成方案較多,而棕櫚酰四肽-7的寥寥無幾。本文主要介紹一種固相多肽合成棕櫚酰四肽-7的方法,選用Fmoc作為氨基酸的氨基保護基,將目的肽的第一個氨基的羧基固體載體二氯樹脂(2-CTC Resin)相連,以形成產(chǎn)物Fmoc-Arg(pbf)-2-CTC Resin為多肽合成的起點,在載體樹脂上使要合成的多肽進行逐個延伸縮合接肽反應,最終合成肽鏈,將其酸解脫去樹脂可得到目標產(chǎn)物的粗品,然后再對粗品進行鑒定和純化可得到最終產(chǎn)品。
Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、棕櫚酰氯、DIC、HoBt、HBTU、2-CTC Resin,均購自吉爾生化上海有限公司;DMF、DCM、異丙醇、甲醇,均為分析純,購自西安浩業(yè)化工有限公司;DIEA、哌啶、乙酸酐,均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。
超聲波清洗器(昆山市儀器有限公司KQ-500B)、循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司 SHB-Ⅲ)、電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司 SE6001F)、制備高效液相色譜儀(創(chuàng)新通恒LC3000)、分析高效液相色譜儀(日立全自動L2000系列)、C18分析色譜柱(大連物理化學研究所4.6mm×250mm)、弱陰離子交換柱(自填體積為150mL 保賽生物科技公司填料粒徑為45~165 μm的DEAE高流速瓊脂糖微球)、C18制備色譜柱(成都科譜生物有限公司,50mm×450mm)。
(1)樹脂活化。將10 g 2-CTC-Resin樹脂(Lot No:GRAS1014-1,Cross-linking:1%DVB,Particle Size:100 ~ 200 mesh,Substitution 1.75 mmol/g)加入反應器中,加入80mL DCM,室溫攪拌浸泡10 min使其充分溶脹活化。
(2)合成Fmoc-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。在步驟(1)的樹脂中加入12.49 g Fmoc-Arg(pbf)-OH、12mL DIEA、100mL DCM,室溫攪拌反應2 h,其中2-CTC Resin、Fmoc-Arg(pbf)-OH、DIEA的摩爾比為1∶1.1∶4,用90mL異丙醇和90mL DMF各進行洗滌兩次,得到保護肽樹脂。
(3)將步驟(2)樹脂肽中加入100mL 20%哌啶的DMF溶液,室溫攪拌反應20 min。抽濾去除溶液,再次加入100mL 20%哌啶的DMF溶液,室溫攪拌反應10 min,除掉2-CTC Resin上的9-芴甲氧羰基基團。用100mL異丙醇和100mL DMF各洗滌兩次。
(4)合成Pro-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。在步驟(3)的樹脂中加入Fmoc-Pro-OH(11.8 g)、HOBT (7.09 g)、DIC(8.2mL)、DMF(90mL),室溫攪拌反應2 h,其中2-CTC-Resin、Fmoc-Pro-OH、HOBT 、DIC的摩爾比為1∶2∶3∶3,用90mL異丙醇和100mL DMF各進行洗滌兩次,得到保護肽樹脂。
(5)合成Gly-Gln(trt)-Pro-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。重復步驟(3)和(4),依次連接Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Gly-OH,得到Gly-Gln(trt)-Pro-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。
(6)合成Pal-Gly-Gln(trt)-Pro-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。將步驟(4)中的樹脂中加入10.7mL棕櫚酰氯、7.24mL DIEA、120mL DCM,室溫攪拌反應20 min。其中2-CTC Resin、棕櫚酰氯、DIEA的摩爾比為1∶2∶2.5,用120mL異丙醇和120mL DMF各洗滌兩次,甲醇洗滌三次,干燥得24 g樹脂肽。
(7)制備棕櫚酰四肽-7配制肽樹脂切割液。將三異丙基硅烷、三氟乙酸、苯甲硫醚、水按體積比為5∶4∶88∶3加入到燒杯內(nèi)攪拌混合。
(8)切割肽樹脂。在步驟(6)肽樹脂中加入200mL切割液,室溫攪拌反應2 h,過濾,濾液在38℃濃縮至油狀物,傾倒到冷凍的400mL無水乙醚中,滴加1.5mL濃鹽酸,大量白色固體析出,攪拌,離心、分離出上清液,室溫減壓烘干,得棕櫚酰四肽-7粗品,經(jīng)反相色譜法純化、濃縮、凍干得到棕櫚酰四肽-7純品11.75 g,純度>95%。
棕櫚酰四肽-7最終產(chǎn)品HPLC分析圖譜如圖1所示。由圖中可以看出,純度>98%,得到純品11.75 g,產(chǎn)率95.91%。
傳統(tǒng)液相法在合成多肽物質(zhì)時有極大的局限性。相比于固相合成,液相法對于二肽和三肽的合成具有很明顯的成本優(yōu)勢,但隨著肽鏈的加長,液相法的操作難度及耗費時長均成倍增加,同時所得產(chǎn)物產(chǎn)率及純度也下降明顯。就本文所述棕櫚酰四肽-7使用常規(guī)液相合成方案進行合成,其合成周期長達3周,而固相法只需要三天;同時,固相法所得產(chǎn)物產(chǎn)量、純度遠遠高于液相法,且液相法合成方案操作復雜程度遠高于固相合成。
圖1 棕櫚酰四肽-7最終產(chǎn)品HPLC分析圖譜
本文介紹的固相法合成棕櫚酰四肽-7方法采用的是HOBT+DIC的縮合體系。其中DIC作為主要的縮合劑,其量越大反應速率越快,根據(jù)實驗表明,最低量不得低于樹脂2.5倍的摩爾質(zhì)量,同時考慮反應放熱,為防止高溫使多肽變性,DIC量不宜過大。由于DIC縮合易產(chǎn)生消旋作用,因此HOBT作為防消旋劑其添加量應與DIC摩爾數(shù)相同。
本文介紹了一種固相法合成棕櫚酰四肽-7的方法,具有操作簡單快捷,副產(chǎn)物少,易于分離純化,可重復性高的特點。相較于液相合成方案,縮短合成時間,合成步驟少,節(jié)省試劑用量,極大的減少了生產(chǎn)成本,同時為日后大規(guī)模生產(chǎn)提供了成熟有效的合成方案。
[1]李校坤,姚成燦,黃亞東,等.生物活性多肽護膚品的基礎及應用[J].日用化學工業(yè),2002,32(5):41-43.
[2]鐘星,郭建維,成秋桂.勝肽在化妝品中的應用和最新進展[J].日用化學工業(yè),2012,35(11):35-36.