劉超，林文鋒，程樹軍

（廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623）

植物保護劑的廣泛使用帶來了嚴重的農(nóng)藥殘留問題，農(nóng)藥的健康風險和環(huán)境風險評估，不僅要考慮農(nóng)藥殘留物本身，還要考慮包括環(huán)境生物中的代謝、降解及反應(yīng)產(chǎn)物，如哺乳動物、禽類、家畜、植物內(nèi)的代謝物數(shù)據(jù)和環(huán)境歸宿（包括土壤、水/沉積物中的微生物降解）數(shù)據(jù)以及毒性數(shù)據(jù)，這些信息需要大量的試驗支持。考慮到動物福利和成本效益等因素，充分利用包括計算機模型和體外測試在內(nèi)的替代方法是一條可行的途徑。一些模擬新陳代謝的計算機方法，如基于知識的毒性定性預測系統(tǒng)（Derek）、基于結(jié)構(gòu)參數(shù)集的優(yōu)化方法（OASIS TIMES）和化學物質(zhì)生物活性預測（PASS）等，已陸續(xù)應(yīng)用于化學物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物毒性的預測[1]。本文以多菌靈為例，用2種計算機專家系統(tǒng)預測微生物和哺乳動物新陳代謝產(chǎn)生的潛在代謝物，用于健康危害評估[2-4]。

1 多菌靈殺菌劑模擬

1.1 多菌靈殺菌劑的特點

多菌靈是甲基苯并咪唑-2-氨基甲酸酯或2-（苯并咪唑基）氨基甲酸甲酯（IUPAC）的通用名稱，它是一種使用范圍廣的內(nèi)吸性殺菌劑，屬于高選擇性苯并咪唑類化合物，主要用于收割前后或者儲存植物的病害防治，能有效抵制多種子囊菌、擔子菌類和半知菌類。歐盟2006/135/EC第一次把多菌靈列入批準使用的植物保護劑指令附件Ⅰ內(nèi)。歐洲食品安全局（EFSA）重新對多菌靈進行了評估。EFSA審查了多個數(shù)據(jù)的變化差距，其中包括紫外光譜、溶解度、電離常數(shù)、土壤中的好氧生物降解途徑等方面的評估。為了探索用代謝模擬工具來填補數(shù)據(jù)差距的可能性，有人用化學反應(yīng)活性和化學歸宿軟件工具CRAFT Explorer v1.0模擬了多菌靈的生物降解途徑，預測其有多種潛在代謝物。對于多菌靈的哺乳動物代謝已有大量文獻報道，利用這些數(shù)據(jù)，可對現(xiàn)有的預測工具（如Meteor 12.0.0和OECD QSAR應(yīng)用工具箱2.0）中關(guān)于代謝模擬的適用性進行評估。

苯并咪唑殺菌劑的作用方式主要依靠徹底親和真菌微管（β微管蛋白亞單位）破壞其增殖過程，如有絲分裂紡錘體的形成、核分裂、細胞骨架形成。對于不同的有機體，苯并咪唑殺菌劑的選擇性毒性及其相對效力有很大不同，主要取決于化學品本身，及所作用的微管蛋白的結(jié)構(gòu)和親和作用。但是苯并咪唑的也會對其他真核細胞產(chǎn)生毒性作用，例如引起植物染色體畸變、改變?nèi)~綠體的光合作用、影響萌芽和幼苗生長、破壞其他生理過程，改變植物細胞代謝，導致植物形態(tài)發(fā)生變化。苯并咪唑殺菌劑會被土壤有機質(zhì)集中吸附，被非目標植物吸收導致對作物產(chǎn)生有害影響。

此外，苯并咪唑殺菌劑對于哺乳動物的毒性也備受關(guān)注，因為多菌靈不僅作為母體“活性”成分，而且還是苯菌靈[1-（正丁胺基甲酰）苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯]和甲基硫菌靈的代謝產(chǎn)物。哺乳動物毒性試驗表明，多菌靈具有一些毒性特點，如對皮膚、眼睛無刺激性，可引起皮膚致敏，大鼠的短期毒性試驗表明可導致肝重量增加、睪丸重量減輕、無精子癥和體重減輕等。由于對有絲分裂紡錘體蛋白干擾的原因，多菌靈可導致（體內(nèi)和體外的）染色體數(shù)目畸變，但是不會導致基因突變或者染色體畸變。大鼠和兔的經(jīng)口發(fā)育毒性試驗證明多菌靈是一種發(fā)育毒劑和致畸劑?；谏鲜鲅芯?，多菌靈的分類標識為致突變原Cat.2（R46）和生殖Cat.2（R60-61），同時提議其為R43（與皮膚接觸可能會導致過敏）。

在代謝物的毒性方面，多菌靈乙酸可代謝為2-AB（氨基苯并咪唑），研究表明后者急性毒性比母體更劇烈，而短期毒性相同。多菌靈可能是來自苯菌靈殺菌劑的代謝產(chǎn)物，通過分裂正丁胺基甲酰母體側(cè)鏈產(chǎn)生。它可由甲基硫菌靈形成，通過硫脲基甲酸酯分裂，硫分裂然后環(huán)化形成咪唑部分。多菌靈的毒性與相關(guān)前體的毒性相比時，得出以下結(jié)論：（1）與苯菌靈相比，多菌靈的急性毒性與之相同，短期毒性和長期毒性都更高，生殖、發(fā)育毒性相同；（2）與甲基硫菌靈相比，多菌靈的急性和長期毒性相同，短期、生殖和發(fā)育毒性更高[5]。

1.2 用CRAFT模擬多菌靈的生物代謝

1.2.1 CRAFT法和模型設(shè)置

為了填補科學數(shù)據(jù)的不足，使用CRAFT Explorer v1.0軟件進行多菌靈生物降解途徑的模擬。該軟件由分子網(wǎng)絡(luò)股份有限公司開發(fā)，源自明尼蘇達大學生物催化和生物降解數(shù)據(jù)庫（UM-BBD）的各種不同環(huán)境反應(yīng)類型的知識庫。簡單來講，為了預測多菌靈的化學反應(yīng)性和歸宿，應(yīng)把多菌靈參與的一系列降解反應(yīng)及其可能得到的產(chǎn)物集中在一起，構(gòu)建模擬降解途徑作為基礎(chǔ)，然后用CRAFT Explorer生成所有從多菌靈開始一直到代謝終點之間一切能想到的反應(yīng)，最終生成三個預測的變量：（1）一個適用于估算的概率模型；（2）取消進一步降解時的標準；（3）概率閾值。

CRAFT Explorer概率模型由幾個反應(yīng)規(guī)律、反應(yīng)類型和分配給各個規(guī)律的概率種類構(gòu)成。反應(yīng)類型是對化學轉(zhuǎn)化的一般定義，提供反應(yīng)形式并注明必要的子結(jié)構(gòu)特性和轉(zhuǎn)化定義。反應(yīng)規(guī)律執(zhí)行某個反應(yīng)類型，把一般定義與具體的反應(yīng)條件和似然估計聯(lián)系起來。軟件中提供了兩個可用的概率模型，即UM-BBD概率模型和酯水解樣品模型。

UM-BBD概率模型是一種生物轉(zhuǎn)化規(guī)律模型，用于評定生物降解反應(yīng)規(guī)律時，充分考慮了氧氣、土壤（濕度適中）或者水體、pH值（中性）、溫度（25℃）、無競爭性或者有其他有毒的化合物這些反應(yīng)條件。在模擬生物降解樹圖中，用下列分配給每個反應(yīng)規(guī)律的模型種類估算規(guī)定條件下每種已確認的反應(yīng)類型的可能性：（1）極有可能發(fā)生的反應(yīng)，即肯定發(fā)生、最優(yōu)先發(fā)生的反應(yīng)；（2）很可能發(fā)生的反應(yīng)，即幾乎所有微生物都能催化，并與存在于分子里的功能團發(fā)生特定反應(yīng)時使用；（3）中性，適用于那些常見的，但在每個模擬系統(tǒng)中并不一定會發(fā)生的反應(yīng)。例如，由于每個基質(zhì)的原因，有些極可能發(fā)生的反應(yīng)可能會，也可能不會發(fā)生，這需要逐案調(diào)查。

根據(jù)UM-BBD概率模型預測，得到多菌靈生物降解模型的概率閾值設(shè)置如下：0～0.2表示不會發(fā)生的反應(yīng)（紅色）；0.3～0.4表示不太可能發(fā)生的反應(yīng)（橙色）；0.5～0.6表示可能發(fā)生的反應(yīng)（黃色表示0.5，淺綠色表示0.6）；0.7～0.8表示很可能發(fā)生的反應(yīng)（綠色）；0.9～1.0表示極有可能發(fā)生的反應(yīng)（深綠色）。

接下來是運行CRAFT Explorer模擬程序，前提是要知道發(fā)生的反應(yīng)量、生成的產(chǎn)物量以及生物降解的步驟數(shù)量，如生物降解層數(shù)，在模擬程序運行時，軟件會把這些因素都考慮在內(nèi)。假如降解步驟增加，所要確認的產(chǎn)物的數(shù)量也相應(yīng)增多，因為要重復提交所有分子（如在各個降解層生成的產(chǎn)物）。為了有效運行多菌靈生物降解模擬程序，應(yīng)選擇步驟的最大數(shù)（如5）使模擬運行最為徹底。最終生物降解模擬前的最后一步是選擇總概率閾值。根據(jù)CRAFT Explorer的解釋，反應(yīng)產(chǎn)物的總概率可以定義為降解樹圖中之前所有產(chǎn)物中產(chǎn)生其中一種產(chǎn)物的概率，如圖1所示選擇總概率閾值可以讓CRAFT生成不太可能產(chǎn)生的產(chǎn)物減少。閾值越大，軟件要確定的產(chǎn)物越少。假如閾值設(shè)置為0.6，則CRAFT Explorer沒有生成總概率值小于0.6的產(chǎn)物。

圖1 CRAFT總概率閾值的定義

1.2.2 多菌靈生物降解樹圖

圖2的生物降解樹圖直觀地說明了多菌靈及其代謝物的整個過程，包括產(chǎn)生每個已確定的降解產(chǎn)物的所有降解路線。多菌靈的生物降解途徑由17個降解步驟構(gòu)成，產(chǎn)生15種不同的降解產(chǎn)物（P2～P16），即從P2[2-氨基苯并咪唑（2-AB）]到P16[1氫-苯并咪唑-2-基氨基甲酸酯（2-氨基甲酸苯并咪唑）][3]。由于產(chǎn)生的所有代謝物與特定的反應(yīng)類型和特定的UM-BBD反應(yīng)規(guī)律有關(guān)，所以CRAFT確認這兩種情況一共產(chǎn)生了7種反應(yīng)類型。總體上看，發(fā)生頻率最高的反應(yīng)類型是UM-BBD bt0005（鄰-未取代的芳香化合物，鄰-二羥基芳族）和UM-BBD bt0367（鄰-未取代的芳香化合物，鄰-雙氫二羥基芳族），兩者反應(yīng)類型都與鄰-未取代的芳香化合物的雙加氧反應(yīng)以及之后的氧化反應(yīng)有關(guān)，導致鄰苯二酚衍生物形成，每種類型都導致不同降解層有4種不同降解產(chǎn)物形成。其他反應(yīng)規(guī)律還包括bt0003（醛羧酸酯）、bt0023（二脂族醚乙醇+醛）、bt0065（1-氨基酸-2-未取代的芳香化合物、鄰-二羥基芳族+胺）、bt0318（氨基甲酰胺+碳酸鹽）、bt0384（單烷基碳酸鹽，烷基-醇）。

圖2 CRAFT Explorer1.0模擬的多菌靈生物降解樹圖

1.3 用Meteor模擬多菌靈的哺乳動物代謝

1.3.1 Meteor法和模型

多菌靈殺菌劑的哺乳動物代謝模擬采用Lhasa公司開發(fā)的Metero v12.0.0軟件。其原理是根據(jù)建立、儲存于知識庫里的新陳代謝方面的專業(yè)知識規(guī)范進行模擬。根據(jù)Metero知識庫的生物轉(zhuǎn)化規(guī)則和推理規(guī)則對多菌靈分子結(jié)構(gòu)進行處理，預測與哺乳動物有關(guān)的代謝產(chǎn)物，生成代謝物的數(shù)量限制在400以內(nèi)，任何給定的途徑中最多生成步驟只有四步，生成多菌靈生物轉(zhuǎn)化過程由三步構(gòu)成：

（1）根據(jù)多菌靈的分子結(jié)構(gòu)搜索知識庫查找生物轉(zhuǎn)化，生成一份潛在代謝物清單；

（2）根據(jù)絕對推理規(guī)則排除生成的代謝物，絕對推理規(guī)則是以文獻中觀察到的發(fā)生率和產(chǎn)出率、基質(zhì)的物理化學性質(zhì)（Log P和分子重量）、基質(zhì)是否是查詢結(jié)構(gòu)、是否是Meteror生成的代謝物等因素為基礎(chǔ)，從而用指定的概率水平選擇代謝物，編制一份更短的代謝物清單。Meteor中與預測的生物轉(zhuǎn)化和代謝物有關(guān)的不確定術(shù)語包括：“可能”（至少有一個有力的正面論據(jù)，并且沒有反對的論據(jù)）、“似乎可能”（有力的證據(jù)支持）、“模棱兩可”（支持和反對的證據(jù)力度相同）、“可疑”（有力證據(jù)反對該假設(shè)）和“不可能”（至少有一個有力的反對論據(jù)證明該假設(shè)是錯誤的，且沒有正面論據(jù)）；

（3）根據(jù)相關(guān)推理規(guī)則，通過對比競爭生物轉(zhuǎn)化以及確定哪個有優(yōu)先轉(zhuǎn)化權(quán)來排除更多代謝物。相關(guān)推理規(guī)則只包括最可能的（即“1級”）生物轉(zhuǎn)化作用。

在完成Meteor分析后，以代謝樹圖的形式把與查詢結(jié)構(gòu)相匹配的知識庫生物轉(zhuǎn)化過程形象地表現(xiàn)出來。

1.3.2 多菌靈代謝樹圖

用Meter12.0.0模擬多菌靈代謝樹圖的結(jié)果如圖3所示，從位于頂部的查詢結(jié)構(gòu)（Q）開始，其后是第一代代謝物（M1—M3），其次是它們在各自母體下面的更多代的代謝物（M4）。該軟件除了可以提供多靈菌生物轉(zhuǎn)化作用的整個途徑外，還可以提供轉(zhuǎn)化的概率水平信息。

圖3 由Meteor 12.0.0模擬的多菌靈代謝樹圖

Meteor12.0.0可以識別多菌靈在哺乳動物體內(nèi)的兩種一期生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，即水解氨基甲酸酯和羥基化稠苯反應(yīng)，以及一種二期生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，即醛糖酸化芳香族醇反應(yīng)。每個生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)由知識庫參考號和參考名進行識別。

水解氨基甲酸酯和羥基化稠苯反應(yīng)被認為是可能發(fā)生在哺乳動物體內(nèi)的反應(yīng)，預測由兩種一期反應(yīng)產(chǎn)生的代謝物M1、M2、M3的概率為“似乎可能”，其主要根據(jù)是多菌靈的親脂特性。非親脂性的反應(yīng)相關(guān)的概率只能是“可疑”。Meteor還提供了一種篩選特殊生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中間體的附加選項，如多菌靈在氨基甲酸酯水解反應(yīng)中形成的兩種中間體，即異氰酸鹽和氨基甲酸，由于其預期的親電性高，所以異氰酸鹽屬于“可能加合形成的”中間體。另外，由于氨基甲酸脫羧基作用極為快迅速，不會聚集或著很難發(fā)現(xiàn)，所以它被稱為“認定的”中間體（Meteor種類-ap）。對于稠苯化合物的羥基化反應(yīng)，代謝物的過程中，應(yīng)用說明2（3）位置比1（4）位置更可能發(fā)生反應(yīng)的關(guān)于氮的補充推理規(guī)則。對于二期生物轉(zhuǎn)化，Meteor12.0.0可以確定芳香族醇醛糖酸化反應(yīng)類型。其發(fā)生概率完全只取決于基團的親脂性，由于基團M3的親脂性為中性，所以估計反應(yīng)為“似乎可能”，因為基團親脂性高，則醛糖酸化反應(yīng)被認為是“可能”的反應(yīng)，基質(zhì)親脂性低，則被認為是“模棱兩可的”反應(yīng)。另外，芳香族醇（苯酚和芳雜環(huán)類似物）硫酸化反應(yīng)被認為是醛糖酸化反應(yīng)的競爭反應(yīng)，但是最終發(fā)生該反應(yīng)的可能性更低。上述多菌靈的結(jié)構(gòu)及所有生成的一期和二期生物轉(zhuǎn)化代謝物的詳細見表1。

表1 由Meteor12.0.0 生成的多菌靈代謝物（警示結(jié)構(gòu)標為紅色）

2 結(jié)果與討論

2.1 多菌靈的生物降解

根據(jù)文獻綜合分析，多菌靈在裸土里被分解時，其半反應(yīng)期為6～12個月，草皮里的半反應(yīng)期為3～6個月，有氧和無氧條件下，在水中的半反應(yīng)期分別為2個月和25個月。主要的微生物代謝產(chǎn)物是2-氨基苯并咪唑（2-AB），然后2-AB被進一步生物降解。

本文用CRAFT軟件預測了多菌靈的P3、P4、P5、P6和所有“二醇”衍生物，其中預測2-AB主要代謝產(chǎn)物，并確認了很多理論上會產(chǎn)生的產(chǎn)物（見表1）。這些預測結(jié)果有助于對該物質(zhì)進行風險評估，了解其主要生物降解路線及產(chǎn)物，便于確定進一步的研究方向。但不能把預測結(jié)果直接用于填補目前的數(shù)據(jù)空白，也不能用于決策。因為，用于監(jiān)管目的還應(yīng)考慮更充足的信息，例如：模擬工具的局限性，證據(jù)是否充分和足夠（例如：可能有某些降解物/代謝物產(chǎn)生的部分證據(jù)），如何用（預測的）毒理學資料補充代謝物信息（例如用QSAR預測工具）等。

2.2 多菌靈的哺乳動物代謝

目前，關(guān)于多菌靈哺乳動物代謝途徑的文獻比較多，包括用大鼠、小鼠、兔、狗、羊和牛的代謝研究。研究表明多菌靈生物轉(zhuǎn)化的基本途徑與羥基化作用有著密切聯(lián)系，其主要代謝物為氨基甲酸甲酯5-羥基苯并咪唑-2-基（5-HBC），次要產(chǎn)物是氨基甲酸甲酯5，6-二羥苯并咪唑-2-基（5，6-DHCB）。羥基化代謝物較容易形成可排泄的硫酸鹽和葡萄糖醛酸結(jié)合物。還有少量的5，6-HOBC氮氧化物。水解作用的主要代謝物是2-氨基苯并咪唑（2-AB）。

比較后發(fā)現(xiàn)，Meteor12.0.0應(yīng)用工具箱預測的代謝物和實驗確認的代謝物差異并不大，主要取決于軟件使用者選定的限制條件，這對于預測的準確性非常關(guān)鍵。由于Meteor用于預測代謝途徑的概率級別為“似乎可能”，所以它只確認多菌靈羥基化作用的主要產(chǎn)物（如5-HBC），并不預測次要代謝物（5，6-DHBC）。同樣，預測葡萄苷酸化5-HBC產(chǎn)生的代謝物（5-HBC-G），而不預測競爭性硫酸化反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物（5-HBC-S），因為該反應(yīng)的概率沒有達到“似乎可能”級別。

如果用不同的Meteor初始設(shè)置來模擬多菌靈的哺乳動物代謝物，可能會得到不同的預測結(jié)果。首先，把最小概率從“似乎可能”改成“模棱兩可”并且選擇“全程”選項，則可模擬產(chǎn)生323種不同的預測代謝物，不僅有來自原始模擬確認的生物轉(zhuǎn)化（如水解氨基甲酸酯、羥基化稠環(huán)和葡萄苷酸化芳香族醇）產(chǎn)生的代謝物，還有如氮氧化芳香氮等概率為“模棱兩可”的其他反應(yīng)產(chǎn)生的代謝物，預測結(jié)果會導致形成實驗確認的代謝物（如5，6-HOBC-氮氧化物）。可見，代謝模擬的結(jié)果完全取決于使用者指定的軟件設(shè)置值，因此必須根據(jù)調(diào)查目的仔細選擇軟件設(shè)置值。

2.3 微生物降解與哺乳動物代謝的相似之處

就微生物降解與哺乳動物代謝之間的相似之處來講，在任何情況下，水解和羥基化都是最重要的反應(yīng)。所有軟件工具都能確認主要多菌靈代謝物2-氨基苯并咪唑（2-AB），它的急性毒性比母體化合物（非劇毒）高。很多母體分子或者形成的（中間體）代謝物的羥基化產(chǎn)物由三種軟件工具進行確認，而這些軟件確認的產(chǎn)物多菌靈哺乳動物代謝的實驗數(shù)據(jù)相一致。

3 結(jié)論

大多數(shù)代謝模擬工具并不僅有唯一的一組預測結(jié)果，使用者應(yīng)根據(jù)調(diào)查目的，通過更改模型限制條件，模擬多種生成途徑和代謝物的可能性。CRAFT Explorer和Meteor都能根據(jù)使用者的調(diào)查目的，擴大或者縮小模擬的范圍來估算形成特定代謝物的概率。這也為使用者完善預測提供了一個合理依據(jù)。如果知道被軟件忽略的反應(yīng)（由于不可能發(fā)生），使用者可以用自己掌握的知識來決定是否也要考慮遺漏的生物轉(zhuǎn)化。如果研究的目的是要確認相關(guān)的有毒代謝物，可以把代謝模擬的結(jié)果和所知道的或預計的代謝物的毒理性質(zhì)一起加以考慮。得到預測結(jié)果后，還可以結(jié)合其他毒理學理論，如根據(jù)TTC法，將代謝剖析圖與母體化合物的毒理學剖析圖進行比較、評估，判定是否任何相關(guān)的有毒代謝物的TTC閾值都小于母體化合物。如果把計算機模擬、現(xiàn)場監(jiān)測和實驗室數(shù)據(jù)整合使用，可以為制定管理決策提供更豐富的預測支持[6]。

[1]程樹軍.化妝品評價替代方法標準實施指南[M].北京:中國標準出版社,2017

[2]Berglof T,Van Dung T,Kylin H & Nilsson I.Carbendazim sorptiondesorption in Vietnamese soils[J].Chemosphere,2002,48:267-273.

[3]CRAFT (Chemical Reactivity and Fate Tool) Explorer 1.0[Z].Molecular Networks GmbH,Erlangen,Germany,http://www.molecular-networks.com/.

[4]Dimitrov SD,Breton R,Macdonald D,et al.Quantitative Prediction of Biodegradability,Metabolite Distribution and Toxicity of Stable Metabolites[J].SAR and QSAR in Environmental Research,2002,13(3-4):445-455.

[5]Dimitrov SD,Kamenska VB,Walker JD,et al.Predicting the Biodegradation Products of Perfluorinated Chemicals Using CATABOL[J].SAR and QSARin Environmental Research,2004,15(1):69-82.

[6]EFSA.Applicability of QSAR analysis to the evaluation of the toxicological relevance of metabolites and degradates of pesticide active substances for dietary risk assessment[J/OL].2010,http://www.efsa.europa.eu/en/scdocs/scdoc/50e.htm