李榮，鄧明芬，徐艷文，曾艷紅，王靜，許言，潘家富，周燦權(quán)

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣州 510080)

1990年，Handyside等[1]利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)完成了世界上首例植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)，經(jīng)過數(shù)十年發(fā)展，PGD結(jié)合各種分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于單基因疾病和染色體的檢測。α地中海貧血是16 號染色體上的α珠蛋白基因的大片段缺失和非缺失突變所引起的單基因遺傳病[2]。我國α地中海貧血攜帶者主要集中在南方地區(qū)，尤其是兩廣地區(qū)，廣西的攜帶率為17.55%，廣東的攜帶率為8.53%[3]。本院在2002年報道了應(yīng)用實時熒光PCR對α地中海貧血進行診斷[4]，2005年又報道了應(yīng)用熒光PCR對α地中海貧血進行診斷[5]。但是這些診斷都是在卵裂期進行活檢，基本上都是活檢一個卵裂球，存在諸多問題，如PCR產(chǎn)量少、擴增失敗率高、等位基因脫扣(allele drop-out，ADO)率高、診斷結(jié)果不符合孟德爾遺傳規(guī)律[6-7]。最近，隨著單細胞全基因組擴增技術(shù)的發(fā)展，已有多個試劑盒可對單細胞或多個細胞進行全基因組的預(yù)擴增增加模板量，各有其優(yōu)缺點[8]。多重置換擴增(Multiple displacement amplification，MDA)是Lizardi等[9]創(chuàng)建的一種基于環(huán)狀滾動擴增的鏈置換擴增技術(shù)，并由Dean等[10]應(yīng)用phi29DNA聚合酶得到了進一步的發(fā)展，具有高擴增效率和高保真等特點。本中心自2016年開始對α地中海貧血患者的胚胎進行囊胚活檢，活檢后采用REPLI-g Single Cell Kit(96)試劑盒先進行預(yù)擴增后再應(yīng)用熒光PCR進行診斷，從而提高診斷的準確性。

本研究回顧性分析本中心2015年1月至2016年11月α地中海貧血PGD周期資料，探討囊胚活檢后用REPLI-g Single Cell Kit(96)試劑盒進行預(yù)擴增后再應(yīng)用熒光PCR進行診斷來提高診斷準確性的效果及可行性。

材料和方法

一、研究對象

回顧性分析本中心2015年1月至2016年11月α地中海貧血PGD周期資料，共139個周期，其中卵裂球活檢后直接應(yīng)用熒光PCR進行診斷的有69個周期(診斷方法一)，囊胚活檢后先進行全基因組擴增后再應(yīng)用熒光PCR進行診斷的有70個周期(診斷方法二)。

二、儀器及試劑

1.儀器：PCR擴增儀(Eppendorf，德國)；倒置顯微鏡(Olympus，日本)；超凈工作臺(K-SYSTEMS，丹麥)；超純水機(Millipore，美國)；3100-Avant遺傳分析儀(ABI，美國)。

2.試劑：蛋白酶K(Sigma，美國)；REPLI-g Single Cell Kit(96)試劑盒(QIAGEN，德國)；Platinum Taq DNA Polymerase(Invitrogen，美國)；10 mmol/L dNTP MIX(Invitrogen，美國)。

3.所用引物：根據(jù)文獻資料[5]設(shè)計合成引物，引物均由上海生工合成。

S1：5’-GTGTTCTCAGTATTGGAGGGA-3’；

S2：5’-FAM-GACACGCTTCCAATACGCTTA-3’；

S3：5’-HEX-CTACTGCAGCCTTGAACTCC-3’。

三、研究方法

1.獲取單個卵裂球：采取常規(guī)排卵方案促排卵，行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)授精，授精后16～18 h觀察受精的情況，取卵后第3天正常受精并且發(fā)育到4細胞以上，細胞碎片<20%的胚胎，采用激光法打孔，活檢1個卵裂球。將活檢的卵裂球在磷酸緩沖液中(含1%牛血清白蛋白)清洗3次，轉(zhuǎn)入含5 μl 堿裂解液[0.08 μl 10 mg/ml 蛋白酶K(Sigma，美國)、0.5 μl 10×PCR buffer、4.5 μl TTH(0.1% Triton-100，0.1% Tween-20，H2O)]的200 μl PCR反應(yīng)管中。每個胚胎樣本均設(shè)置陰性對照，并將最后一個清洗的液滴轉(zhuǎn)移等量體積到200 μl PCR反應(yīng)管中。

2.獲取滋養(yǎng)層細胞：采取常規(guī)排卵方案促排卵，行ICSI授精，授精后16～18 h觀察受精情況，取卵后對第5天囊胚評分為3BB、第6天囊胚評分為4CB/4BC的胚胎采用激光法打孔[11]，活檢5～10個滋養(yǎng)層細胞。將活檢的卵裂球在磷酸緩沖液中(含1%牛血清白蛋白)清洗3次，轉(zhuǎn)入含3.5 μl REPLI-g Single Cell Kit(96)試劑盒中的PBS緩沖液的200 μl PCR反應(yīng)管中。每個周期選擇一個胚胎樣本設(shè)置陰性對照，將最后一個清洗液滴轉(zhuǎn)移等量體積至200 μl PCR反應(yīng)管中。

3.單細胞裂解：將轉(zhuǎn)移了卵裂球的200 μl PCR反應(yīng)管進行裂解，條件為45℃ 15 min，96℃ 20 min。裂解后進行熒光PCR。

4.MDA擴增：滋養(yǎng)層細胞轉(zhuǎn)入200 μl PCR管中后加入3 μl D2裂解10 min，溫度為65℃。裂解完后放冰盒上，加入3 μl Stop Solution，瞬時離心。配制全基因組擴增體系：H2O 9 μl，REPLI-gReaction Buffer 29 μl，REPLI-gDNAPolymerase 2 μl。將40 μl混合液加入到裂解后的200 μl PCR管中進行擴增。

5.熒光PCR：H2O 26.2 μl，50 mmol/L MgCl21.5 μl，10×PCR buffer 4.5 μl，10 mmol/L dNTP 1.5 μl，擴增α珠蛋白基因的引物(濃度為10 mmol/L)S1、S2、S3各2 μl，Taq酶0.3 μl(invitrogen，美國)，裂解模板DNA 5 μl。

6.毛細管電泳：3100-AVant遺傳分析儀電泳，電泳體系：Gene ScanTM-500Liz 0.5 μl，HiDiTMFormamide 8.5 μl，DNA模板2 μl。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、胚胎實驗室指標

本研究共診斷α地中海貧血139個周期，其中診斷方法一69個周期，共654個胚胎，診斷方法二70個周期，共533個胚胎。兩種診斷方法中患者的平均女方年齡、平均獲卵數(shù)、平均正常受精數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，但方法二的平均活檢個數(shù)顯著小于方法一(P<0.05)(表1)。

二、兩種診斷方法的結(jié)果

兩種診斷方法的結(jié)果中，方法一的正常胚胎率、異常胚胎率、診斷失敗率都顯著高于方法二(P<0.05)，但雜合子胚胎率顯著降低(P<0.05)。方法二的臨床妊娠率高于方法一，但無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 α地中海貧血兩種診斷方法的實驗室指標比較 (-±s)

注：與方法一比較，*P<0.05

表2 α地中海貧血兩種診斷方法的結(jié)果比較 [n(%)]

注：與方法一比較，*P<0.05

討 論

PGD在臨床的應(yīng)用已經(jīng)有了豐富的經(jīng)驗，但仍然存在單細胞PCR產(chǎn)物少、擴增失敗、ADO等諸多問題。有文獻報道單淋巴細胞的ADO率為6%～43.9%[12-13]，同時也有研究報道人類胚胎單個卵裂球的ADO率為0%～25%[14-16]。本研究中的α地中海貧血是單基因遺傳病，理論上應(yīng)當(dāng)符合孟德爾遺傳規(guī)律，地中海貧血的正常胚胎率、雜合子胚胎率、異常胚胎率理論上應(yīng)為25%、50%、25%。方法一的正常胚胎率、雜合子胚胎率、異常胚胎率分別為35.22%、30.11%、30.11%，嚴重偏離理論比值。而方法二的正常胚胎率、雜合子胚胎率、異常胚胎率為25.87%、50.19%、23.94%，接近理論值，與方案一比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。同時方法二的診斷失敗率也顯著降低了(P<0.05)。方法一與方法二診斷結(jié)果的差異可能就是ADO及活檢細胞數(shù)所導(dǎo)致的。卵裂期胚胎只能活檢1～2個細胞，囊胚能活檢5～10個滋養(yǎng)層細胞，而且滋養(yǎng)層細胞是發(fā)育成胎盤，因此囊胚活檢對胚胎的損失可能更小。隨著活檢和冷凍技術(shù)的發(fā)展，囊胚活檢后進行冷凍已成為一種趨勢。2013年Chang等[17]報道囊胚活檢后進行多重置換擴增后微測序的擴增失敗率和ADO率都是5%，而卵裂球的擴增失敗率和ADO率分別是13%和16%，顯著高于前者。本中心嘗試過活檢囊胚期滋養(yǎng)層細胞直接應(yīng)用熒光PCR對α地中海貧血進行診斷，但由于細胞數(shù)的增加，裂解的效果并不是很好，同時我們想獲得更多的PCR產(chǎn)物進行更多的實驗，比如高齡α地中海貧血患者或者既有α地中海貧血又有染色體易位攜帶的患者，在診斷地中海貧血的同時還要診斷染色體是否正常，因此對α地中海貧血的診斷也進行囊胚期滋養(yǎng)層細胞活檢后先行全基因組擴增獲得足夠的PCR產(chǎn)物后再應(yīng)用熒光PCR進行診斷。Wilton等[18]在2009年提到2 538個單基因疾病的PGD周期中，PCR擴增診斷中有12個發(fā)生誤診，誤診率為0.47%。Lewis 等[19]的研究提出ADO是造成PGD誤診的主要原因。從診斷結(jié)果看方法一中可能是ADO導(dǎo)致部分雜合子胚胎診斷成了正常胚胎和異常胚胎，但α地中海貧血診斷中只要出現(xiàn)正常峰值，就不會出現(xiàn)重型水腫胎的可能性。

全基因組擴增技術(shù)(Whole genome amplification，WGA)能以最小的擴增偏倚對全基因組序列進行非選擇性擴增來增加微量DNA的擴增產(chǎn)物，獲得大量的遺傳信息，為PCR、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)、比較基因組雜交技術(shù)(CGH)、單核甘酸多肽性(SNP)和二代測序技術(shù)(NGS)等方法提供足夠的模板DNA。根據(jù)其擴增原理，WGA可分為兩大類，第一類是基于PCR技術(shù)的WGA方法：引物延伸預(yù)擴增法(Primer extension preamplification，PEP)、簡并寡核苷酸引物PCR法(Degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)、連接介導(dǎo)PCR(ligation-mediated PCR，LM-PCR)。第二大類是恒溫全基因組擴增反應(yīng)：MDA、基于引物酶的全基因組擴增法(Primer-based whole genome amplification，pWGA)、多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù)(Multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)。在這些WGA方法中，MDA具有高效擴增率和高保真度等特點，是目前公認的應(yīng)用最廣泛的WGA方法。早在2002年就有報道MDA技術(shù)應(yīng)用于人類基因組的擴增[20]。Burlet等[21]在2006年報道將MDA技術(shù)應(yīng)用于脆性X綜合征的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷。WGA擴增有丟失目的片段的可能性，本研究中囊胚期滋養(yǎng)層細胞活檢數(shù)目是5～10個，只要有一個細胞的目的片段擴增成功就可以診斷。即使出現(xiàn)目的片段丟失，結(jié)果會顯示診斷失敗，可對胚胎二次活檢進行診斷。

綜上所述，囊胚期滋養(yǎng)層細胞活檢后先進行全基因組擴增后再應(yīng)用熒光PCR進行診斷的結(jié)果比卵裂球活檢后直接應(yīng)用熒光PCR進行診斷的結(jié)果更符合孟德爾遺傳規(guī)律，診斷失敗率顯著降低。同時方法二的活檢胚胎數(shù)顯著降低，但臨床妊娠率有所提高。因此，囊胚活檢后先進行全基因組擴增后再應(yīng)用熒光PCR對α地中海貧血進行診斷的結(jié)果更加準確，效果更好，是一種更好的診斷方法。

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