趙 絢，何興東，張京磊

（南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071）

柴油是由石油烴和芳烴組成的混合物，是石油的重要組分，具有較強(qiáng)的粘著力和較低的乳化力[1-2]，可將土壤顆粒聚合成較為致密的片層狀或團(tuán)狀結(jié)構(gòu)體，導(dǎo)致土壤孔隙度降低，滲透阻力增加，透水性和透氣性減弱[3-4]。同時(shí)柴油富含的元素與無(wú)機(jī)氮、磷結(jié)合并限制硝化作用和脫磷酸作用，從而使土壤有效氮和有效磷含量減少[5]。柴油污染物通過(guò)降低土壤水分和養(yǎng)分供應(yīng)致使幼苗生理脫水和養(yǎng)分失衡，阻礙植物正常生長(zhǎng)[6]。

原油/柴油污染土壤對(duì)植物生長(zhǎng)適應(yīng)性的研究多集中于葉綠素含量[7]、抗氧化酶活性[8]等，而氮/磷比也是反映植物是否遭受環(huán)境脅迫的關(guān)鍵因素之一[9-10]。張京磊等[11]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽漬化脅迫下，隨土壤中原油濃度的增大，油葵幼苗根部氮/磷比顯著減小，株高和地上生物量的相對(duì)生長(zhǎng)率也顯著減小。土壤改良劑可有效緩解原油/柴油污染物對(duì)土壤水分和養(yǎng)分的制約，有效調(diào)節(jié)土壤理化性質(zhì)[12]、對(duì)土壤氮、磷有明顯的保蓄作用[13]，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。張京磊等[11]研究指出，在鹽漬化原油污染土壤中，隨著鋸末體積分?jǐn)?shù)的加大，油葵株高和地上生物量相對(duì)生長(zhǎng)率均顯著增加。韓濤等[14]研究發(fā)現(xiàn)，施氮磷鉀肥可顯著促進(jìn)蘇丹草株高、根長(zhǎng)、干重的增大，使其耐受性得到了提高。但目前對(duì)于土壤改良劑增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的作用原理卻少有研究。

為了進(jìn)一步探討柴油對(duì)植物生長(zhǎng)的脅迫效應(yīng)，并對(duì)土壤改良劑改善植物生長(zhǎng)的作用機(jī)制進(jìn)行研究，以黑麥草（Lolium perenne L.）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分析了土壤柴油污染下黑麥草幼苗的生長(zhǎng)情況以及葉片和根部氮/磷比變化，考察了施加鋸末、氮磷肥后黑麥草幼苗生長(zhǎng)情況的變化及氮/磷比的調(diào)節(jié)，以期為增強(qiáng)土壤柴油污染下植物的生長(zhǎng)適應(yīng)性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

以黑麥草為供試植物，開(kāi)展柴油單因素盆栽實(shí)驗(yàn)和鋸末-硝酸銨（氮肥）-磷酸二氫鉀（磷肥）3因素4水平正交改良實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)?；谇捌谘芯康?1種植物對(duì)原油的耐受力為1%和天津大港原油污染樣地的現(xiàn)狀，單因素實(shí)驗(yàn)中柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的4個(gè)水平依次設(shè)定為0%、0.3%、0.6%和0.9%，正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示，正交實(shí)驗(yàn)采用L16（45）正交（表2）。

實(shí)驗(yàn)用多年生黑麥草種子購(gòu)于天津田園花卉種子公司，0號(hào)柴油購(gòu)自加油站，鋸末（原木種類(lèi)為松木，粒度為3 mm）取自木材廠，硝酸銨（分析純）和磷酸二氫鉀（分析純）購(gòu)于天津化學(xué)試劑有限公司，實(shí)驗(yàn)用PVC塑料盆為口大底端小的倒圓臺(tái)形狀。土壤取自南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院網(wǎng)室0~20 cm表層清潔壤土，土壤有機(jī)質(zhì)含量為38 g·kg-1，全氮含量為1.3 g·kg-1，全磷含量為 0.90 g·kg-1。分別稱(chēng)取 4 份（4 個(gè)處理）質(zhì)量為7.5 kg（分為3個(gè)重復(fù)）的清潔壤土（土壤容重為 1.45 g·cm-3），依次倒入體積為 0、30、60、90 mL的柴油（柴油容重為0.75 kg·L-1），充分混勻自然風(fēng)干7 d后進(jìn)行黑麥草幼苗移栽；正交實(shí)驗(yàn)土壤（所有處理土壤柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%）由質(zhì)量為120 kg的清潔壤土、添加體積為1440 mL的柴油和360 g的氯化鈉充分混勻配制而成，充分混勻自然風(fēng)干7 d后進(jìn)行黑麥草幼苗移栽。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 L16（45）3因素4水平正交Table 2 The orthogonal table of three factors and four levels

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院網(wǎng)室內(nèi)用穴盤(pán)育苗，育苗基質(zhì)為蛭石，在每穴孔表面播撒事先用蒸餾水浸泡過(guò)的飽滿(mǎn)的黑麥草種子3~5粒，然后蓋上一層紙膜，澆水至滲透，待種子萌發(fā)后揭掉紙膜，保持穴盤(pán)濕潤(rùn)。單因素育苗25 d后進(jìn)行移栽，每盆從穴盤(pán)中選取大小一致的幼苗3株，每處理3個(gè)重復(fù)，共12盆。移苗后每盆澆蒸餾水300 mL以緩苗，實(shí)驗(yàn)期間每3 d澆蒸餾水300 mL。

在進(jìn)行柴油單因素實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，育苗以備正交實(shí)驗(yàn)。穴盤(pán)育苗30 d后，由于黑麥草幼苗根系生長(zhǎng)較發(fā)達(dá)且緊密，故將其轉(zhuǎn)入裝有蛭石的PVC塑料盆中以供生長(zhǎng)。幼苗生長(zhǎng)45 d后進(jìn)行移栽，每盆從PVC塑料盆中選取大小一致的幼苗3株，每處理3個(gè)重復(fù)，共48盆。移苗后每盆澆蒸餾水300 mL以緩苗，實(shí)驗(yàn)期間每3 d澆蒸餾水300 mL。

單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行60 d和40 d。收獲黑麥草幼苗，用蒸餾水充分淋洗并吸干水分后用直尺測(cè)量每株幼苗的株高和根長(zhǎng)，用分析天平稱(chēng)量幼苗地上部和地下部鮮重，然后將樣品裝入封口袋內(nèi)，于-80℃冰箱中保存以測(cè)定指標(biāo)。植物全氮含量測(cè)定采用濃H2SO4-H2O2消煮-凱氏定氮法[15]，植物全磷含量測(cè)定采用濃H2SO4-H2O2消煮-鉬銻抗比色法[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013處理，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時(shí)計(jì)算正交實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)的小組和與小組極差，并作圖，之后利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)合單因素方差分析中的LSD多重比較檢驗(yàn)不同處理數(shù)據(jù)間的差異顯著性（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴油污染土壤對(duì)黑麥草幼苗生長(zhǎng)與體內(nèi)氮/磷比的影響

柴油單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，黑麥草幼苗株高、地上部和地下部生物量與對(duì)照處理無(wú)顯著差異；柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)，黑麥草幼苗株高、地上部和地下部生物量比對(duì)照處理分別下降了43.01%、93.80%、84.21%，且達(dá)到顯著下降水平；隨柴油濃度進(jìn)一步增大為0.9%時(shí)，黑麥草幼苗株高、地上部和地下部生物量繼續(xù)下降，分別較對(duì)照顯著降低了58.87%、98.07%、91.23%；柴油污染對(duì)黑麥草幼苗的根長(zhǎng)無(wú)顯著影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)觀察黑麥草幼苗的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%和0.9%時(shí)，黑麥草幼苗呈現(xiàn)植株矮小、葉片枯黃甚至萎蔫的表征，說(shuō)明在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%和0.9%的柴油脅迫下黑麥草幼苗生長(zhǎng)遭受了脅迫或毒害效應(yīng)。

圖1 土壤柴油污染對(duì)黑麥草幼苗生長(zhǎng)的影響Figure 1 Effects of soil diesel pollution on the growth of L.perenne seedlings

圖2 土壤柴油污染對(duì)黑麥草幼苗葉片和根部全氮、全磷含量和氮/磷比的影響Figure 2 Effects of soil diesel oil pollution on the N and P concentrations and N/P ratio in the leaves and roots of L.perenne seedlings

對(duì)黑麥草幼苗葉片和根部全氮、全磷含量進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果（圖2）表明，在葉片部，與對(duì)照處理相比，全氮含量隨土壤中柴油濃度增大而顯著減小（P<0.05），全磷含量在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)顯著增大，氮/磷比在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%和0.9%時(shí)顯著降低（P<0.05）。在根部，與對(duì)照處理相比，全氮含量和氮/磷比在柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%和0.9%時(shí)顯著降低（P<0.05），全磷含量無(wú)明顯變化（P>0.05）。

進(jìn)一步對(duì)黑麥草幼苗株高、地上部生物量與葉片氮/磷比，以及根長(zhǎng)、地下部生物量與根部氮/磷比進(jìn)行回歸分析，結(jié)果（表3）表明，黑麥草幼苗株高、地上部生物量與葉片氮/磷比顯著正相關(guān)，地下部生物量與根部氮/磷比顯著正相關(guān)，但根長(zhǎng)與根部氮/磷比間回歸關(guān)系不顯著。

2.2 柴油污染土壤改良下黑麥草生長(zhǎng)適應(yīng)性與氮/磷比調(diào)節(jié)

鹽漬化柴油污染土壤改良的小組極差值分析結(jié)果（表4）表明，在鋸末、硝酸銨、磷酸二氫鉀3種改良劑中，施加鋸末對(duì)黑麥草幼苗株高、地上生物量、葉片全氮含量、葉片氮/磷比有較大的影響，施加氮肥對(duì)黑麥草幼苗株高、葉片全氮含量、葉片氮/磷比的影響次之；施加磷肥對(duì)黑麥草葉片全磷含量有較大的影響。

通過(guò)SPSS19.0單變量分析計(jì)算得到正交實(shí)驗(yàn)中每種土壤改良劑不同水平下黑麥草幼苗株高和地上生物量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)一步分析不同改良劑對(duì)黑麥草幼苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果（圖3）表明，與對(duì)照處理相比，施加鋸末體積分?jǐn)?shù)為10%和15%時(shí)黑麥草幼苗的株高分別顯著增加了27.48%和19.33%（P<0.05），施加氮肥量為 0.1 g·kg-1和 0.2 g·kg-1時(shí)黑麥草幼苗的株高分別顯著增加了12.84%和16.35%（P<0.05）；與對(duì)照處理相比，施加鋸末體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)黑麥草幼苗的地上生物量顯著增加了24.70%，施氮和施磷處理對(duì)地上生物量無(wú)顯著影響。

土壤改良劑對(duì)黑麥草葉片全氮、全磷含量的影響結(jié)果（圖4）表明，與對(duì)照處理相比，施加鋸末體積分?jǐn)?shù)為10%和15%時(shí)，黑麥草葉片全氮含量顯著增高，施加鋸末體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)葉片氮/磷比顯著增大；與對(duì)照處理相比，氮肥施加量為0.2 g·kg-1和0.3 g·kg-1時(shí)，黑麥草葉片全氮含量和氮/磷比均顯著增高，氮肥施加量為0.3 g·kg-1時(shí)葉片全磷含量顯著降低；與對(duì)照處理相比，磷肥施加量為0.1 g·kg-1和0.15 g·kg-1時(shí)葉片全磷含量顯著增高，施加磷肥對(duì)黑麥草葉片全氮含量和氮/磷比無(wú)顯著影響。

表3 土壤柴油污染下黑麥草幼苗氮/磷比與生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)性Table 3 Relevance of N/P ratio and growth indices in L.perenne seedlings under diesel polluted soil

表4 柴油污染下土壤改良劑對(duì)黑麥草幼苗生長(zhǎng)及全氮、全磷含量的組極差值比較Table 4 Comparisons of group range value of growth and nitrogen and phosphorus concentrations in L.perenne seedlings with soil improvements under diesel polluted soil

圖3 柴油污染土壤改良對(duì)黑麥草幼苗生長(zhǎng)狀況的影響Figure 3 Effects of soil improvements on growth indices in L.perenne seedlings under diesel pollution

3 討論

圖4 柴油污染下土壤改良劑對(duì)黑麥草葉片全氮、全磷含量的影響Figure 4 Effects of soil improvements on nitrogen and phosphorus concentrations in leaves of L.perenne seedlings under diesel pollution

原油/柴油污染土壤生物修復(fù)過(guò)程中毒性的植物指示多體現(xiàn)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)（株高、地上部生物量、根鮮重）和葉片生理指標(biāo)（葉綠素含量、MDA含量）[16]，對(duì)于體現(xiàn)植物生態(tài)化學(xué)計(jì)量學(xué)規(guī)律，反映植株生長(zhǎng)狀況的植物葉片氮/磷比[17]卻少有涉及，葉片氮/磷比是植物生長(zhǎng)養(yǎng)分限制的敏感性指數(shù)[18-19]。生長(zhǎng)率假說(shuō)[20-21]表明，生長(zhǎng)速率高的生物體需要相對(duì)更多的富磷R(shí)NA來(lái)滿(mǎn)足體內(nèi)蛋白質(zhì)的快速合成，由于對(duì)磷素的大量消耗，快速生長(zhǎng)的植物體氮/磷比往往較低，這時(shí)植物氮/磷比的變化主要是由磷的供給所決定的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照處理相比，柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%和0.9%時(shí)，黑麥草幼苗株高、地上部和地下部生物量均顯著下降，黑麥草幼苗遭受了柴油污染物的毒性脅迫，正常生長(zhǎng)受到限制。進(jìn)一步分析黑麥草幼苗葉片和根部元素含量變化發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照處理相比，柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%和0.9%時(shí)，黑麥草幼苗葉片和根部全氮含量和氮/磷比均顯著減小。這與張京磊等[11]對(duì)油葵的研究結(jié)果類(lèi)似，即土壤原油污染下油葵的生長(zhǎng)狀況與根部氮/磷比均同步顯著減小。這可能是由于植物遭受土壤原油/柴油污染脅迫時(shí)，原油/柴油污染物阻礙植物對(duì)氮的吸收，造成供氮不足，植物體內(nèi)氮/磷比減小，進(jìn)而導(dǎo)致植物正常生長(zhǎng)受到制約。

土壤改良劑是增加植物株高和生物量的措施之一。正交改良實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的柴油污染鹽漬化土壤中，施加體積分?jǐn)?shù)為10%的鋸末可顯著增大黑麥草幼苗的株高和地上生物量，施加體積分?jǐn)?shù)為15%的鋸末可顯著增大黑麥草幼苗的株高，而這主要是由于鋸末的施加可使黑麥草葉片全氮含量和氮/磷比顯著增大。張京磊等[9]在前期油葵對(duì)土壤原油污染的適應(yīng)性與改良措施研究中指出，煤渣、沸石、脫硫石膏和鋸末4種改良劑中，鋸末在改良鹽漬化原油污染土壤方面效果最為顯著，隨著鋸末體積分?jǐn)?shù)的加大，油葵株高和地上部生物量相對(duì)生長(zhǎng)率均顯著增加，超氧化物歧化酶（SOD）活性逐漸降低，這是由于鋸末本身疏松多孔，保水性較好，透氣性也較好，鋸末對(duì)原油也具有一定的吸附性，本身可能作為吸附劑來(lái)吸附土壤中的原油和鹽分，大大緩解了對(duì)油葵的脅迫。本研究中鋸末對(duì)黑麥草幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用推測(cè)可能是由于鋸末作為土壤保水劑，可減少土壤水分、養(yǎng)分的流失，增強(qiáng)土壤的保水性，同時(shí)對(duì)土壤氮、磷具有明顯的保蓄作用，可顯著提高石油污染土壤中氮、磷的含量[13]，促進(jìn)植物的養(yǎng)分吸收，進(jìn)而改善植物生長(zhǎng)狀況。同時(shí)施加氮磷肥的處理結(jié)果表明氮肥施加量為0.2 g·kg-1時(shí)黑麥草幼苗株高、葉片全氮含量和氮/磷比顯著增高，這是由于氮素的施加為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供了必要的營(yíng)養(yǎng)肥料，氮素作為葉綠素的組成成分，氮素的增多可使光合作用有關(guān)酶的表達(dá)增強(qiáng)，加速蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)植物代謝活動(dòng)和生長(zhǎng)發(fā)育[22]。本研究中磷肥的施加并無(wú)顯著效果，推測(cè)可能是因?yàn)榱追实氖┘硬⒉荒苤苯佑行У鼐徑獠裼臀廴疚飳?duì)黑麥草幼苗氮素吸收的限制。

4 結(jié)論

與對(duì)照處理相比，當(dāng)土壤中柴油濃度為0.9%時(shí)，黑麥草葉片和根部全氮含量及氮/磷比均顯著降低，黑麥草生長(zhǎng)受到抑制；而當(dāng)向該油污土壤中施加體積分?jǐn)?shù)為10%的鋸末時(shí)，會(huì)顯著提高黑麥草葉片全氮含量和氮/磷比，增大生物量和株高，增強(qiáng)黑麥草幼苗的生長(zhǎng)適應(yīng)性。

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