范瑞娟，郭書海，李鳳梅，吳 波

（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽 110016；3.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)重點實驗室，銀川 750021）

在復(fù)雜的石油烴成分中，烷烴（包括環(huán)烷烴）以及多環(huán)芳烴分布最廣，所造成的環(huán)境問題也最嚴(yán)重[1]。生物修復(fù)技術(shù)操作簡單、處理費用低、對環(huán)境影響小，因而在石油烴類污染土壤的修復(fù)中被廣泛應(yīng)用[2-6]。微生物作為生物修復(fù)的功能主體，其種類、群落組成、活性、數(shù)量等對有機物的去除效率和生物利用途徑起著決定性作用。不同的微生物所包含的酶系及其代謝途徑不同，因而所能利用的污染物種類也不同，而石油烴組成成分復(fù)雜，需要將不同種類的菌株進行混合，制成微生物降解菌群，以實現(xiàn)石油烴不同組分最大程度的去除[7-8]。土壤pH和營養(yǎng)物質(zhì)的比例對微生物生長有重要作用，從而對污染物生物降解產(chǎn)生重要影響，因而有必要對土壤環(huán)境條件進行優(yōu)化，以提高微生物的活性和數(shù)量[9-10]。污染物結(jié)構(gòu)組成和性質(zhì)直接決定了其生物可利用性，然而，由于石油烴類污染物的生物可利用性很差，僅憑微生物修復(fù)技術(shù)很難實現(xiàn)其高效去除[11]。近年來，人們開始使用微生物-電動耦合技術(shù)以提高土壤中頑固性有機物，如石油烴的去除[12-14]。

電動技術(shù)對土壤的修復(fù)作用依賴于一系列的電化學(xué)過程，包括電遷移、電滲析、電泳以及電化學(xué)氧化在土壤中所誘導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)[15-16]。對于石油烴這種難遷移的疏水性有機物，在電場作用下主要依靠電化學(xué)氧化的方式得以去除[17]，且在一定的范圍內(nèi)，電化學(xué)反應(yīng)區(qū)域隨電場強度的增大而擴大，從而使污染物的去除率得以提高[18]。另外，在電動處理過程中，土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)、電子受體、微生物等的遷移率得以促進，進而使污染物的生物可利用性得到加強[19-20]。另有研究表明，在電極附近水的電解作用會導(dǎo)致極端pH的發(fā)生和土壤含水率的變化，對微生物的生長具有負(fù)面影響。如，Lear等[21]研究發(fā)現(xiàn)，電場的施加導(dǎo)致陽極區(qū)域土壤酸化，使得可培養(yǎng)細菌和真菌的數(shù)量均有所降低，最終削弱了污染物降解效率。然而，周期性切換電極極性可消除土壤含水率和pH的大幅變化，降低對微生物的危害[22-24]。

目前，由于缺乏直接的監(jiān)測手段，大多數(shù)的研究都集中在電場對生物降解的影響方面，而對電化學(xué)反應(yīng)的研究較少，但間接的證據(jù)已證明了電化學(xué)反應(yīng)在持久性污染物的去除方面所起的重要作用[25-26]。在微生物-電動聯(lián)合修復(fù)中，污染物的去除不僅依賴于微生物的降解作用，還在很大程度上依賴于電化學(xué)氧化作用[27-31]。然而，微生物降解和電化學(xué)氧化分別在去除不同石油烴組分時的具體作用還不明確。

本文分別以正十六烷、環(huán)十二烷和芘作為直鏈烷烴、環(huán)烷烴和多環(huán)芳烴的代表性污染物，以三者所組成的混合有機污染物為研究對象，在二維對稱電場修復(fù)平臺上，采用電動修復(fù)（EK）、微生物修復(fù)（BIO）和微生物-電動聯(lián)合修復(fù)（BIO-EK）的方式，通過分析不同修復(fù)方式中不同烴類污染物降解的時空特征和微生物數(shù)量、活性變化，探討微生物降解和電化學(xué)氧化分別在去除不同石油烴組分時的具體作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗土壤

試驗土壤采自中國科學(xué)院沈陽生態(tài)實驗站附近（41°31′0.19″N，123°22′8.77″E）0~30 cm 土壤，其部分理化性質(zhì)見表1。使用前將土壤自然風(fēng)干并過篩（<2 mm）。

表1 土壤理化性質(zhì)初始值Table 1 Initial characteristics of the test soil

1.1.2 污染物

分別以正十六烷（純度>98%，東京化成工業(yè)株式會社）、環(huán)十二烷（純度>99%，東京化成工業(yè)株式會社）和芘（純度>99%，百靈威科技有限公司）作為直鏈烷烴、環(huán)烷烴和多環(huán)芳烴的代表性污染物。將正十六烷、環(huán)十二烷和芘混入土壤中，使其最終濃度分別為4 744.54、947.22 mg·kg-1和 48.81 mg·kg-1，室溫狀態(tài)下平衡一周。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：5 g·L-1牛肉膏，10 g·L-1蛋白胨，5 g·L-1NaCl，pH 7.0~7.2。

無機鹽培養(yǎng)基：1.5g·L-1NaNO3，1.5g·L-1（NH4）2SO4，1.0 g·L-1K2HPO4，0.5 g·L-1MgSO4·7H2O，0.5 g·L-1KCl，0.01 g·L-1FeSO4·7H2O，0.002 g·L-1CaCl2，pH 7.0。

1.1.4 降解菌

以前期所構(gòu)建的微生物降解菌群為供試微生物，該降解菌群包含直鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴降解能力的6 株菌 B1、B2、B3、B6、B7和 B9，其中 B2和 B3對直鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴均具有降解能力，B1、B6、B7和 B9對直鏈烷烴和環(huán)烷烴具有降解能力，初步鑒定B1、B2、B6和B7分別屬于 Hydrogenophaga sp.、Phenylobacterium sp.、Sphingobium sp.和Bacillussp.，B3和B9屬于Arthrobacter sp.[32]。將細菌活化后，接入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，用 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)（150 r·min-1、35℃），3 d后用低溫離心機（4℃）進行離心（8000 r·min-1、2 min），將離心所得菌體懸浮于無機鹽培養(yǎng)基中備用。

1.2 試驗設(shè)計及試驗裝置

試驗裝置如圖1所示，包括土壤室（100 cm×100 cm×25 cm）、25根圓柱形不銹鋼電極（20 cm×1 cm）、直流電源、溫度探頭、pH計、控制系統(tǒng)和實時監(jiān)測系統(tǒng)。25根電極以矩陣的形式排列，電極間距為20 cm；控制系統(tǒng)可對電極極性按設(shè)定的時間間隔進行陰陽極極性的切換，并可將電極極性以行/列轉(zhuǎn)換的形式進行旋轉(zhuǎn)切換，以此形成一個二維的對稱電場；監(jiān)測系統(tǒng)可對土壤溫度、pH等參數(shù)進行實時監(jiān)測。

試驗設(shè)計如表2所示。其中BIO-EK和EK在圖1所示的裝置中進行，施加的直流電場為1.0 V·cm-1，每5 min切換一次電極極性，每10 min進行一次行與列之間的轉(zhuǎn)換。土壤中所投加的微生物比例和數(shù)量以及土壤pH和C∶N∶P等均按照前期試驗結(jié)果來確定[32]。BIO-EK和BIO污染土壤中按照前期試驗所確定的比例 （B1∶B2∶B3∶B6∶B7∶B9=1∶1∶2∶0.5∶1∶2） 及接種量（2%）投加微生物混合菌群后測得的可培養(yǎng)細菌數(shù)量為 1.0×106CFU·g-1干土；調(diào)節(jié)土壤 pH 為 7.0；綜合考慮土壤中污染物、有機碳、速效氮和速效磷的濃度，調(diào)節(jié)C∶N∶P 為 100∶5∶1，其中 N 由 NaNO3和（NH4）2SO4提供，P由K2HPO4提供。用蒸餾水調(diào)整土壤的含水量至20%，試驗過程中，定期向土壤箱中噴灑蒸餾水以保持該含水量。將土壤分層鋪放在土壤室內(nèi)并壓實，每個土壤室中約100 kg。采樣點根據(jù)電場強度分布，每10 d從圖2所示位置（a點：電極處；c點：兩電極中間；e點：對角線中心）進行采樣，將各相同位點的土樣混勻后測定相應(yīng)指標(biāo)，試驗共進行100 d。

圖1 試驗裝置Figure 1 Schematic of the experimental set-up

圖2 采樣點分布等高線圖Figure 2 Contour plots signifying the distribution of sampling positions

式中：C0為污染物初始含量；Ct為降解后的污染物含量。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤中正十六烷、環(huán)十二烷以及芘含量的測定

土壤中正十六烷、環(huán)十二烷和芘的含量采用氣相色譜法測定[32]。

1.3.2 正十六烷、環(huán)十二烷和芘降解率的計算

正十六烷、環(huán)十二烷和芘的降解率按照下面公式進行計算：

表2 試驗設(shè)計Table 2 Experimental protocol

實際降解率=處理組降解率-對照組降解率

1.3.3 脫氫酶活性分析

脫氫酶活性根據(jù) TTC（2，3，5-Triphenyl TetrazoliumChloride，2，3，5-氯化三苯基四氮唑）還原法測定[33]。其原理是TTC在細胞呼吸過程中接受氫以后，可以還原為紅色的 TPF（Triphenyl Formazan，三苯基甲臜），TPF在485 nm處存在吸收峰。

1.3.4 可培養(yǎng)細菌數(shù)量變化

可培養(yǎng)微生物數(shù)量分析采用平板菌落計數(shù)法[34]。準(zhǔn)確稱取1 g土樣，置于9 mL無機鹽培養(yǎng)液中，140 r·min-1振蕩6 h。吸取1 mL菌液，用滅菌的去離子水進行梯度稀釋，直至合適的濃度。分別取各稀釋濃度的菌液100 μL均勻涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板上，待菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，將培養(yǎng)皿倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h后統(tǒng)計菌落數(shù)量，計算每克土壤中菌落數(shù)量（CFU·g-1土）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖形繪制采用 SigmaPlot 10.0（Systat Software，USA）；方差分析采用 SPSS 17.0（SPSS Software,USA）中“Duncan”法。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤中正十六烷、環(huán)十二烷和芘的降解

2.1.1 正十六烷、環(huán)十二烷和芘含量的變化

圖3為不同處理組中正十六烷、環(huán)十二烷和芘含量隨時間和空間的變化情況。100 d后，除對照組外，各處理方式下正十六烷、環(huán)十二烷和芘的濃度均有明顯的下降，且各污染物最大去除均發(fā)生在BIOEK處理組中。在試驗進行的前10 d，各污染物降解速率最快。

EK處理中，在未添加降解菌，也未進行土壤條件優(yōu)化的情況下，正十六烷、環(huán)十二烷和芘也發(fā)生了明顯的降解。由于極強的疏水性，這類有機污染物很難通過電滲析、電遷移和電泳的方式得以去除，而當(dāng)土壤中存在“微導(dǎo)體”，即具有電子傳導(dǎo)特性的粒子（如金屬氧化物等）時，在外加電場的情況下，這些粒子能夠誘使污染物發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)[35]。因此，間接說明EK中污染物的去除在很大程度上依賴于電化學(xué)氧化作用。各污染物最大去除均發(fā)生在BIO-EK處理組中，說明在BIO-EK處理過程中，污染物的降解依賴于微生物降解和電化學(xué)氧化的聯(lián)合作用。所添加的微生物降解菌群包含直鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳烴降解能力的不同菌株，其綜合了不同菌在降解石油烴不同組分過程中所體現(xiàn)出的優(yōu)勢，可實現(xiàn)不同菌株代謝途徑的互補。前10 d污染物降解速率最大，后期則逐漸降低。對于EK而言，可能由于初期土壤中積累的中間產(chǎn)物較少，污染物去除速率較大，而隨著中間產(chǎn)物的積累，使得污染物去除速率逐漸降低。對于BIO-EK和BIO而言，除以上原因之外，還可能由于菌群和營養(yǎng)物質(zhì)的添加解決了土壤中微生物活性低下和營養(yǎng)缺乏的問題，使得前10 d污染物降解速率最大，后期隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗使得微生物活性和數(shù)量降低，從而導(dǎo)致污染物去除緩慢[36]。

2.1.2 不同位點正十六烷、環(huán)十二烷、和芘降解率隨時間變化

圖4表示不同采樣點（a點、c點和e點）土壤中正十六烷、環(huán)十二烷和芘降解率隨時間的變化情況。

由圖4A、圖4D、圖4G可知，100 d后，BIO-EK中a點、c點和e點正十六烷降解率分別為79.0%、75.7%和71.4%，EK中a點、c點和e點降解率分別為38.1%、30.6%和25.4%，而BIO中的平均降解率為40.9%。進一步說明，在BIO-EK處理過程中，污染物的降解依賴于微生物降解和電化學(xué)氧化的聯(lián)合作用，而結(jié)合EK和BIO中正十六烷的降解率，可推知在BIO-EK修復(fù)中，對于正十六烷的去除，微生物降解的貢獻大于電化學(xué)氧化作用，并且可以看出，EK中正十六烷的降解率隨電場強度的減弱而逐漸降低，由此說明電化學(xué)氧化作用的貢獻率隨電場強度的減弱而逐漸降低。在一系列脫氫酶的催化作用下，正十六烷被依次氧化成相應(yīng)的醇、醛、酸，生成的正十六酸通過β-氧化的過程被繼續(xù)降解，而電場不僅可以促進正十六烷的單末端氧化，還可促進正十六酸的β-氧化過程[37]。這可能也是BIO-EK中正十六烷降解效率最高，并且電極附近電化學(xué)氧化的貢獻值較大的重要原因。

由圖4B、圖4E、圖4H可知，100 d后，BIO-EK中a點、c點和e點環(huán)十二烷降解率分別為93.9%、91.1%和86.8%，EK中a點、c點和e點降解率分別為51.6%、48.8%和44.2%，BIO中平均降解率為41.5%。表明在BIO-EK處理過程中，對于環(huán)十二烷的去除，電化學(xué)氧化的貢獻大于微生物降解作用。BIO-EK中環(huán)十二烷降解效率最高，并且電極附近電化學(xué)氧化的貢獻值較大，可能的原因是，電場可加速環(huán)十二烷的開環(huán)進程，使其轉(zhuǎn)換成易于被生物降解的線形物質(zhì)[38]。

圖4 BIO、EK和BIO-EK土樣中不同采樣點（a、c和e）正十六烷、環(huán)十二烷和芘降解率隨時間的變化Figure 4 Degradation extent of n-hexadecane，cyclododecane and pyrene at different positions（a，c and e）in the BIO，EK and BIO-EK tests

由圖 4C、圖 4F、圖 4I可知，100 d后，BIO-EK 中a點、c點和e點芘的降解率分別為87.9%、82.9%和78.0%，EK中a點、c點和e點降解率分別為43.0%、36.7%和32.4%，BIO中的平均降解率為44.4%。表明在BIO-EK處理過程中，對于芘的去除，微生物降解的貢獻大于電化學(xué)氧化作用，尤其在場強較弱的c點和e點。該結(jié)果與Huang等[28]的研究結(jié)果相似，其研究是以1-D電場為修復(fù)平臺，以單一污染物芘為研究對象進行的。

綜上，在微生物-電動聯(lián)合修復(fù)過程中，微生物降解和電化學(xué)氧化在不同污染物的去除中體現(xiàn)出了互補性，其中正十六烷和芘的去除較多地依賴于微生物的降解作用，而環(huán)十二烷的去除則較多地依賴于電化學(xué)氧化作用。且微生物降解作用在場強較弱的位點貢獻較大，而電化學(xué)氧化作用在場強較強的電極附近貢獻較大。

2.2 脫氫酶活性和可培養(yǎng)細菌數(shù)量的變化

脫氫酶活性是表征微生物活性的一個重要指標(biāo)，是生物細胞內(nèi)催化有機物氧化（脫氫），并將電子傳遞給最終電子受體的氧化還原酶，而這個電子傳遞的過程是土壤微生物呼吸途徑的一個重要部分[39]。因此，本研究選擇脫氫酶作為評價土壤微生物活性的指標(biāo)。

BIO-EK和BIO處理中，土壤脫氫酶活性和可培養(yǎng)細菌數(shù)量隨時間和空間變化情況如圖5所示。BIO-EK處理組中，前期脫氫酶活性和細菌數(shù)量逐漸上升，至40 d達到最大值，而后則逐漸下降，但100 d后脫氫酶活性和細菌數(shù)量仍高于初始值。a點、c點和e點之間脫氫酶活性和細菌數(shù)量均沒有顯著性差異（P>0.05）。BIO處理組中，10 d時脫氫酶活性和細菌數(shù)量達到最大（P<0.01），隨之逐漸降低至與初始脫氫酶活性和細菌數(shù)量相似。整體來看，BIO-EK中脫氫酶活性和細菌數(shù)量明顯高于BIO中（P<0.01）。

圖5 BIO-EK及BIO處理土壤中脫氫酶活性和可培養(yǎng)細菌數(shù)量變化Figure 5 Changes of dehydrogenase activity and culturable bacterial numbers in the BIO-EK and BIO tests

可能由于試驗初期對土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的比例和pH進行了調(diào)節(jié)，土壤環(huán)境有利于微生物的生長，從而使得前期脫氫酶活性和細菌數(shù)量逐漸上升，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，導(dǎo)致脫氫酶活性和細菌數(shù)量的降低。由于電場方向的周期性改變，使得土壤中不同位點pH均一，營養(yǎng)物質(zhì)分散均勻，故脫氫酶活性和細菌數(shù)量在空間上沒有明顯的差異[40]，與前期研究結(jié)果一致[31]。BIO-EK中脫氫酶活性和細菌數(shù)量高于BIO中，可能的原因是，當(dāng)向土壤中施加電場時，陽極附近由于水的電解作用所產(chǎn)生的氧氣會促進微生物細胞的呼吸速率，并間接提高土壤氧化還原水平，從而引起微生物活性和數(shù)量的增加[41]，且電場方向的周期性改變增強了微生物與營養(yǎng)物質(zhì)之間的傳質(zhì)性[42]，也有可能引起微生物活性和數(shù)量的增加。

3 結(jié)論

在微生物-電動聯(lián)合修復(fù)混合烴污染土壤的過程中，微生物降解作用和電化學(xué)氧化作用在不同烴類成分的去除中表現(xiàn)出較為明顯的互補性，其中正十六烷和芘的去除較多地依賴于微生物的降解作用，而環(huán)十二烷的去除則較多地依賴于電化學(xué)氧化作用，且微生物降解作用在場強較弱的位點貢獻較大，而電化學(xué)氧化作用在場強較強的電極附近貢獻較大。研究結(jié)果有望為石油烴類污染物的微生物-電動修復(fù)過程調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。

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