李 娟，田保華，劉旦梅，裴雁曦*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2.太原理工大學(xué)，太原 030024）

硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S），一直以來被認為是一種有毒氣體，并且具有臭雞蛋氣味。然而在氣體信號分子一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后，H2S也成為了氣體信號分子的一員[1]，雖然其研究起步較晚，但發(fā)展迅速[2]。起初，H2S被證明在動物體內(nèi)有多種生理功能。近年來，已經(jīng)有許多研究報道證明植物內(nèi)源H2S也有多種生理生化功能，如在種子的萌發(fā)[3]、根形態(tài)的建成、植物的光合作用和細胞程序性死亡等生理過程中都發(fā)現(xiàn)有H2S的參與[3-5]；此外H2S在對植物抗逆性方面也扮演著重要的角色，如抵抗干旱脅迫[6]、溫度脅迫、重金屬脅迫[7-8]等。總之，植物整個生長、發(fā)育、成熟和衰老的過程都有H2S的參與。

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）是生物細胞中的一種活性物質(zhì)，三磷酸腺苷酶（Adenosine triphosphatase，ATPase）在ATP分解釋放出能量過程中扮演著重要的角色。ATPase主要包括F型、P型、V型和ABC型四類[9]。主要定位于植物細胞的葉綠體內(nèi)膜和線粒體內(nèi)膜，還有少部分存在于微生物中，其活性受環(huán)境以及各種因素的影響。ATP是生命活動的主要物質(zhì)，ATPase在植物細胞的生長、氣孔開閉、跨膜運輸以及抵御非生物脅迫等方面有重要作用[10]。

P型ATPases作為ATPase家族中的一個成員，在植物響應(yīng)重金屬脅迫方面有著重要的作用。它們可以通過氨基酸序列中的天冬氨酸殘基的磷酸化循環(huán)使一些陽離子進行跨膜運輸。P型ATPase主要包括P1A-ATPase和 P1B-ATPase，HMA 是 P1B-ATPase亞家族中一員，亞家族根據(jù)其金屬特征可分為Zn2+/Cd2+/Pb2+/Co2+組和Cu+/Ag+組。對于Cd脅迫產(chǎn)生毒害作用的關(guān)鍵步驟是根部吸收并向地上部分運輸，因此削弱Cd向上運輸，從而阻止Cd進入木質(zhì)部和韌皮部是一個研究熱點[10-11，13]，但是，不同物種的HMA家族對Cd脅迫的響應(yīng)存在差異。

目前，對于Cd脅迫處理下ATPase和H2S的關(guān)系，以及H2S與具有金屬轉(zhuǎn)運蛋白活性的P1B-ATPase亞家族中HMA的關(guān)系尚無相關(guān)研究報道，本研究以谷子幼苗為材料，研究H2S在植物響應(yīng)重金屬Cd的過程中，H2S與ATPase及HMA之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

晉谷21號由山西農(nóng)科院谷子所提供。

1.2 培養(yǎng)條件

選用萌發(fā)后生長5 d的幼苗作為實驗材料。種子消毒處理：將種子放于相應(yīng)的離心管，75%的乙醇洗1 min，棄掉乙醇后用濃度為6%的次氯酸鈉洗10 min，最后用無菌水清洗3次。然后將消毒后的種子播種于培養(yǎng)皿中，23℃黑暗浸泡24 h。并且每天換10 mL新的1/4 Hoagland營養(yǎng)液，保持水分[17]。

1.3 脅迫處理

在進行脅迫處理時，選取生長一致的谷子幼苗分為4組。其中3組分別用5 mmol·L-1CdCl2（Cd）、50 μmol·L-1NaHS（H2S）、50 μmol·L-1NaHS 與 5 mmol·L-1CdCl2（H2S+Cd）進行處理，另外1組未處理的幼苗作為對照（CK）。所有實驗進行三次重復(fù)，其中H2S處理采用熏蒸法處理，將50 μmol·L-1NaHS置于小蓋子中放入培養(yǎng)皿中進行H2S處理。分別處理24 h后取樣，然后測定ATPase的活性以及HMA基因的表達量。

1.4 生理指標(biāo)測定

可溶性蛋白含量和可溶性糖含量測定參照李合生[18]的方法。

1.5 ATPase酶活性的測定

剪取1 g谷子幼苗，加入2倍（體積∶質(zhì)量）體積預(yù)冷的研磨緩沖液（50 mmol·L-1Tris-MES，250 mmol·L-1甘露醇，1.5%PVP，0.5%BSA，1 mmol·L-1DTT，pH 7.0），在冰上研磨，然后在4℃冷凍離心機下5000 r·min-1離心3 min，取上清測定ATPase的活性[19]。

H+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase 活性的測定：反應(yīng)體系為1 mL，Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase的反應(yīng)體系中包括Tris-Mes 50 mmol·L-1（pH 6.5）、ATPNa23.0 mmol·L-1、（NH4）2MoO41.0 mmol·L-1、NaN31.0、NaNO350 mmol·L-1、EDTA-Na20.1 mmol·L-1；H+-ATPase的反應(yīng)體系除Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase體系中所包含的試劑，還包括CaCl23.0 mmol·L-1、MgCl25.0 mmol·L-1。以上三種酶反應(yīng)均由 50 μL 的 60 mmol·L-1ATP-Na2進行啟動，水浴37℃下反應(yīng)30 min，最后終止反應(yīng)進而測定無機磷的含量。

1.6 谷子幼苗HMA家族蛋白進化分析

谷子幼苗HMA家族蛋白進化分析，用NCBI網(wǎng)站中 BlastP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）查找與HMA蛋白同源性高的序列，然后用 ClustalW（http：//www．ebi．a(chǎn)c．uk/clustalw/）對所找的同源序列進行排序并分析，用MEGA 5.0軟件的最大簡約法（MP）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)為BootStrap，重復(fù)1000次。

1.7 RNA提取和Real-time PCR

分別取各處理組的谷子幼苗，用RNAiso Plus試劑進行RNA的提取，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，具體操作方法按照試劑的說明書進行。以cDNA為模板，用谷子ACTIN基因作為內(nèi)參，用熒光定量PCR儀進行檢測，最后分析各處理組基因表達水平的變化，每個實驗均重復(fù)3次。表1為用于Real-time PCR的引物，表2為Real-time PCR反應(yīng)體系。

1.8 實驗數(shù)據(jù)分析

用Excel和SPSS 12.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，然后用t檢驗進行顯著性分析和圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2S對Cd脅迫下谷子幼苗的可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響

如圖1所示，與對照組相比，Cd處理、H2S處理以及H2S+Cd處理的可溶性蛋白含量略微降低，降幅分別為4.2%、3.1%和1.5%，三種不同處理對谷子幼苗的可溶性蛋白含量幾乎沒有影響；Cd處理可溶性糖的含量明顯降低，而H2S+Cd處理則可以緩解Cd脅迫所引起的可溶性糖含量的降低。糖是調(diào)節(jié)滲透脅迫的小分子物質(zhì)。以上實驗結(jié)果表明，H2S可以通過增加谷子幼苗可溶性糖的含量進而緩解重金屬Cd導(dǎo)致的滲透脅迫的損傷。

圖1 H2S處理對Cd脅迫下谷子幼苗可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Figure 1 Effects of H2S on soluble protein and soluble sugar contents in foxtail millet seedlings under Cd stress

表2 Real-time PCR反應(yīng)體系Table 2 Real-time quantitative PCR reaction system

2.2 H2S對Cd脅迫下谷子ATPase活性的影響

如圖2所示，與對照組比較，Cd處理的Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase和H+-ATPase活性顯著降低；H2S處理的Mg2+-ATPase活性高于對照，而H+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性與對照相比沒有顯著變化；與Cd處理組相比，H2S+Cd處理的H+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性顯著上升，Mg2+-ATPase的活性也有所升高，但并不顯著。以上實驗結(jié)果表明，H2S可以提高Cd脅迫下谷子ATPase活性，增加ATP等生物能量的生成，從而增強根系的主動吸收，進而緩解Cd脅迫對谷子幼苗的損傷。

圖2 H2S對Cd脅迫下谷子幼苗ATPase活性的影響Figure 2 Effect of H2S on ATPase enzyme activity in foxtail millet seedlings under Cd stress

表1 Real-time PCR特異性引物Table 1 Primers used for Real-time quantitative PCR

2.3 谷子HMA家族蛋白系統(tǒng)進化分析

從擬南芥序列庫中查找出8個HMAs的家族相關(guān)蛋白，分別命名為AtHMA1-8，接下來，通過比對的方法又從谷子數(shù)據(jù)庫中找出11條相關(guān)基因。對這19條HMA基因編碼蛋白按距離法（Neighbor-joining method）構(gòu)建了它們的進化樹，如圖3所示在擬南芥中有4個基因?qū)儆贑u+/Ag+亞家族，分別為AtHMA5-8，而谷子中該亞家族中有6個成員；對于Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亞家族，擬南芥中有蛋白AtHMA1-4 4個成員，而谷子中含有5個成員并且其中的2個與AtHMA1親緣關(guān)系很近，將其命名為SiHMA1-1、SiHMA1-2。由以下分析結(jié)果可得出，家族分類結(jié)果與其功能基本是一致的。

2.4 H2S對HMAs家族基因表達的影響

為了研究H2S緩解Cd脅迫的分子機理，直接參照擬南芥HMA家族基因序列設(shè)計引物，并通過qRT-PCR在谷子中擴增出目的片段，對Cd脅迫下，H2S對谷子Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亞組中 HMA1-4的表達量進行了分析，實驗結(jié)果如圖4顯示，Cd處理 組 SiHMA1-1、SiHMA1-2、SiHMA2、SiHMA3 和SiHMA4顯著上調(diào)，與之相比，H2S+Cd處理組5個基因的表達量則均有顯著的下調(diào)。綜上結(jié)果表明，H2S可能通過調(diào)節(jié)谷子幼苗中起金屬轉(zhuǎn)運作用的HMAs家族基因的表達量，來緩解Cd脅迫對谷子幼苗的損傷。

圖3 谷子和擬南芥HMAs家族系統(tǒng)樹Figure 3 Phylogenetic analysis of the foxtail millet seedlings and Arabidopsis HMAs family proteins

3 討論

ATP是一種高能磷酸化合物，是細胞各項生命活動的能量供應(yīng)。而根系的主要功能之一為吸收水分和無機鹽，這一過程則需要ATPase催化ATP水解進而提供能量。位于細胞質(zhì)膜上的H+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase是較為重要的ATP酶類，其活性可直接反映出細胞質(zhì)膜的作用，并且質(zhì)膜H+-ATPase所構(gòu)成的跨膜質(zhì)子梯度，是根部吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要驅(qū)動力。已有研究報道1 mmol·L-1CdCl2能夠顯著抑制根系的質(zhì)膜H+-ATPase活性。這表明1 mmol·L-1CdCl2可以將細胞質(zhì)膜的功能破壞，同時也對根系主動吸收的能力有所抑制[19]；同時也有研究報道，不同濃度的CdCl2脅迫處理對龍葵和長春花等幼苗的H+-ATPase、Ca2+-ATPase 活性影響比較顯著[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CdCl2脅迫下Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase和H+-ATPase的活性顯著被抑制，而H2S處理則可以緩解這一現(xiàn)象，這與H2S可以緩解Al對小麥ATPase活性的抑制[24]這一研究報道相一致。盡管Cd脅迫對ATPase的影響有眾多研究，但并無一致的結(jié)果，因此在這方面還值得進一步深入研究。

圖4 H2S對谷子HMAs家族金屬轉(zhuǎn)運基因的表達調(diào)控Figure 4 The expression levels of the HMAs family of the metal transporter genes under H2S treatment

P型ATPases存在于大部分真核生物中，它們對生物體的離子運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及穩(wěn)態(tài)維持，尤其是在應(yīng)對環(huán)境脅迫的生理過程中發(fā)揮著重要作用。P型ATPases家族成員中 P1B-ATPases（HMAs）則為植物中的重要金屬轉(zhuǎn)運蛋白。HMAs亞家族分為Cu+/Ag+和Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+兩個亞族，研究報道擬南芥AtHMA1-4屬于Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亞族[10]。本研究利用生物信息學(xué)方法，在谷子中預(yù)測到有5個編碼基因?qū)儆赯n2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亞組。進一步的Real-time PCR表達分析（圖4）表明，H2S處理使得在Cd脅迫下谷子幼苗中 SiHMA1-1、SiHMA1-2、SiHMA2、SiHMA3 和 SiHMA4表達的上調(diào)有所抑制。由此推測，根細胞內(nèi)的Cd往地上部分運輸時受H2S抑制，從而將Cd集中于根細胞的液泡中，進而緩解了Cd對谷子幼苗的損傷。這一結(jié)果與H2S可以下調(diào)龍葵HMA4基因的表達，抑制Zn向地上部分轉(zhuǎn)運，從而緩解Zn對龍葵幼苗的毒害[26]結(jié)果相一致。AtHMA3和OsHMA3可使得Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+儲存于植物液泡當(dāng)中，AtHMA3也是唯一能使Cd在葉片中積累發(fā)生變化的一個轉(zhuǎn)運蛋白[11]；而擬南芥HMA家族中的另外兩成員HMA2、HMA4和水稻中OsHMA2的主要功能則是分別把根中Zn和Cd從根細胞中運輸至地上部分[10-11]。從以上分析可以推測，不同物種中的HMAs家族基因及其亞組中的轉(zhuǎn)運蛋白都有著功能差異性。

因此，本實驗研究H2S在谷子幼苗響應(yīng)重金屬Cd脅迫機制中的作用，為進一步深入研究谷子對重金屬Cd的調(diào)控機制提供理論支持。但是，目前對HMAs家族的功能及更深的研究尚不清楚。因此，對谷子中HMAs家族進行詳細的功能分析與基因定位是我們后續(xù)研究的方向。

4 結(jié)論

（1）在Cd脅迫處理下谷子幼苗會產(chǎn)生一系列生理指標(biāo)和轉(zhuǎn)錄水平的變化，主要表現(xiàn)有可溶性糖和可溶性蛋白含量均降低，三種ATP酶活性下降，以及P1B-ATPase轉(zhuǎn)運家族HMAs的基因表達升高，從而導(dǎo)致谷子幼苗受到不同程度的損傷。

（2）H2S處理則可以增加Cd脅迫下谷子幼苗的可溶性糖含量，提高Cd脅迫下谷子幼苗的三種ATP 酶活性，下調(diào) HMA1、HMA2、HMA3和 HMA4基因的表達，從而提高根系主動吸收能力，將Cd集中于根細胞的液泡中，進而緩解Cd對谷子幼苗的損傷。

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