周茜，王唯霖，郭曉曉，楊光，趙文（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

周茜，王唯霖，郭曉曉，楊光，趙文*
（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

研究烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。采用80%乙醇對(duì)烏梅進(jìn)行提取，測(cè)定總黃酮含量為22.98 mg RE/ g FM，烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度為20 mg/mL，經(jīng)醇提物處理后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜通透性明顯增加，培養(yǎng)液中核酸大分子物質(zhì)、Ca2+含量和總漏出率增加，細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂。研究為烏梅作為天然食品添加劑開(kāi)發(fā)研究提供了科學(xué)參考。

烏梅；金黃色葡萄球菌；抑菌作用

烏梅，又稱(chēng)酸梅、黑梅等，是薔薇科植物梅果的主要加工產(chǎn)品之一。作為我國(guó)的一種特種資源，烏梅使用歷史悠久，具有斂肺澀腸、生津止渴、驅(qū)蟲(chóng)止痢等功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為中品，是一種重要的藥食同源物品［1］。研究發(fā)現(xiàn)烏梅含有多種活性物質(zhì)，包括有機(jī)酸、萜類(lèi)、黃酮、脂類(lèi)等，具有抑菌、抗氧化、抗炎癥、降血糖及免疫增強(qiáng)效果等多種生物學(xué)活性［2］。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的食源性革蘭氏陽(yáng)性菌，可引起人類(lèi)和動(dòng)物化膿感染，也是造成人類(lèi)食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一［3］。研究表明，因受金黃色葡萄球菌污染而引起的感染占食源性疾病發(fā)病原因的第二位，我國(guó)近年來(lái)發(fā)生的金黃色葡萄球菌食物中毒情況也不容樂(lè)觀［4］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)植物提取物可以顯著發(fā)揮抑菌活性，因此在食品工業(yè)中作為保鮮劑替代品越來(lái)越受到關(guān)注。本試驗(yàn)室前期對(duì)不同極性烏梅提取物研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏梅醇提物具有較好的抑菌作用，因此本文擬采用烏梅醇提物研究對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用，為其作為天然食品添加劑開(kāi)發(fā)及烏梅資源的深入研究提供了科學(xué)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

烏梅：購(gòu)于保定萬(wàn)寶堂藥房，60℃恒溫烘箱中烘干，多功能高速粉碎機(jī)粉碎，60目過(guò)篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于Sigma公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、酵母浸粉、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉浸膏、蛋白胨：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；無(wú)水乙醇等其它試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：保存于

1.2儀器設(shè)備

BL-100型高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市松青五金工具廠；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-150S-II生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ZHJHC1112B超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1烏梅醇提物的制備

稱(chēng)取烏梅粉末5g，加入80%乙醇75mL，浸泡過(guò)夜，50℃超聲波振蕩提取30 min，過(guò)濾取上清液。重復(fù)提取一次，兩次提取濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥得烏梅醇提物固體，測(cè)定時(shí)提取物溶解并稀釋到相應(yīng)濃度。1.3.2總黃酮含量測(cè)定［5］

黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密稱(chēng)取在120℃烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.5 mg于100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容至刻度，制成105 μg/mL的蘆丁對(duì)照溶液。精確吸取蘆丁對(duì)照溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于具塞試管中，用70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇補(bǔ)足10 mL，然后加入5%NaNO2溶液0.8 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.8 mL，搖勻，靜置6 min，最后加入4%NaOH溶液10 mL，搖勻，蒸餾水定容至刻度，靜置15 min，測(cè)定510 nm處吸光度值。以蘆丁對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

樣品總黃酮含量測(cè)定：將烏梅醇提物稀釋至合適濃度，參照上法進(jìn)行測(cè)定。以提取溶劑作為空白對(duì)照。將吸光度值代入回歸方程，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果以每克烏梅中含有蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品等量物來(lái)表示（mg RE/g FM）。1.3.3烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用研究1.3.3.1最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用瓊脂平板稀釋法測(cè)定烏梅醇提物MIC［6］。將烏梅醇提物進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)c培養(yǎng)基充分混勻，使其終質(zhì)量濃度為50、40、30、20、10、5 mg/mL，加入到培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用無(wú)菌移液器吸取50 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期金黃色葡萄球菌菌懸液，均勻涂布，37℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落生長(zhǎng)情況。以無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低烏梅醇提物濃度為MIC。

1.3.3.2對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁通透性的影響［7］

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，分別加入烏梅醇提物使其終質(zhì)量濃度為MIC和2MIC，37℃、150r/min繼續(xù)培養(yǎng)。于0、2、4、6、8 h時(shí)吸取菌液，3 500 r/min離心10 min，取上清液，用試劑盒測(cè)定堿性磷酸酶（AKP）的含量，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3.3對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響

分別于0、2、4、6、8 h時(shí)取1.3.3.2中試驗(yàn)組與對(duì)照組菌懸液，3 500 r/min離心10 min，取上清液，用DDS-307A（DDB-600）型電導(dǎo)儀測(cè)定上清液電導(dǎo)率。以不含烏梅醇提物菌懸液為對(duì)照，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3.4對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)容物含量的影響

分別取1.3.3.2中試驗(yàn)組與對(duì)照組培養(yǎng)8 h菌懸液10 mL于離心管中，4 000 r/min離心5 min，取上清液，分別測(cè)定核酸大分子物質(zhì)含量、鈣離子含量及總漏出率。核酸大分子物質(zhì)含量測(cè)定：測(cè)定260 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。鈣離子含量測(cè)定：依照鈣試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定中鈣離子含量?？偮┏雎蕼y(cè)定：測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。重復(fù)3次，取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，并用鄧肯氏法多重比較檢驗(yàn)各處理之間差異顯著性（P＜0.05）。

2　結(jié)果與分析

2.1烏梅醇提物總黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.012 3x+0.002，R2=0.999。烏梅醇提物總黃酮提取含量為22.98 mg RE/g FM?？傸S酮測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1　 總黃酮測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of total flavonoids contents

2.2烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.2.1最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果Table 1　MIC of ethanol extract of Fructus mume against Staphylococcus aureus

由結(jié)果可知，烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯，MIC為20 mg/mL。

2.2.2對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁通透性的影響

堿性磷酸酶（AKP）位于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜間隙之中，正常情況下不向外分泌，只有當(dāng)細(xì)胞壁受到破壞，通透性增大后，堿性磷酸酶才會(huì)釋放到到胞液中。因此測(cè)定細(xì)胞外AKP含量變化可反映細(xì)胞壁通透性變化［8］。烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁通透性的影響見(jiàn)圖2。

圖2　烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁通透性的影響Fig.2　Effects of ethanol extract of Fructus mume on the cell wall permeability of Staphylococcus aureus

由圖2結(jié)果可知，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，MIC和2MIC烏梅醇提物處理菌液中AKP含量持續(xù)升高，當(dāng)達(dá)到6h時(shí)，含量達(dá)到最高，分別為6.39 U/mL和8.19 U/mL。隨后趨于平穩(wěn)狀態(tài)，且含量高于對(duì)照組。說(shuō)明烏梅醇提物處理使金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁通透性增加，導(dǎo)致了胞外堿性磷酸酶含量增加。

2.2.3對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜是細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)，物質(zhì)交換、信息識(shí)別等生理功能均需通過(guò)細(xì)胞膜才能正常進(jìn)行。當(dāng)外界環(huán)境處于生長(zhǎng)不利條件時(shí)，菌體細(xì)胞內(nèi)K+、Na+等電解質(zhì)外滲，菌液電導(dǎo)率增加，這直接反映細(xì)胞膜滲透性情況；同時(shí)電解質(zhì)外滲導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑受阻，嚴(yán)重影響菌體的正常生長(zhǎng)［9］。烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性影響見(jiàn)圖3。

圖3　烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig.3　Effects of ethanol extract of Fructus mume on the cell membrane permeability of Staphylococcus aureus

由圖3可知，在0 h～6 h內(nèi)，處理組電導(dǎo)率隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而呈持續(xù)升高現(xiàn)象，當(dāng)大于6 h后，電導(dǎo)率增加趨勢(shì)平緩。不同處理組電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照組，且2MIC高濃度烏梅醇提物處理組電導(dǎo)率變化顯著。說(shuō)明烏梅醇提物處理后金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞電解質(zhì)滲出量增大，膜滲透性增加，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性受到破壞。

2.2.4對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)容物含量的影響

烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌菌液上清液中核酸大分子物質(zhì)、Ca2+含量和總漏出率測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2　烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌內(nèi)容物含量的影響Table 2　Effects of ethanol extract of Fructus mume on the intracellular constituents of Staphylococcus aureus

與對(duì)照組相比，經(jīng)烏梅醇提物處理8 h后，不同處理組金黃色葡萄球菌的核酸大分子物質(zhì)、Ca2+含量和總漏出率均有差異顯著性。2MIC烏梅醇提物處理組Ca2+含量和總漏出率顯著高于MIC處理組，而核酸大分子物質(zhì)沒(méi)有顯著差異。

3　結(jié)論

烏梅醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為20 mg/mL。經(jīng)過(guò)烏梅醇提物處理后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的通透性明顯增加，培養(yǎng)液中核酸大分子物質(zhì)、Ca2+含量和總漏出率增加，細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂。烏梅醇提物總黃酮含量為22.98 mg RE/g FM，表明烏梅醇提物可能通過(guò)黃酮作用破壞菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，引起細(xì)胞內(nèi)容物的外漏，從而發(fā)揮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。

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Antibacterial Effect of Fructus mume Ethanol Extracts on Staphylococcus aureus

ZHOU Qian，WANG Wei-lin，GUO Xiao-xiao，YANG Guang，ZHAO Wen*
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

The antibacterial mechanism of Frucuts mume ethanol extracts against Staphylococcus aureus was studied.The total flavonoids content of ethanol extract was 22.98 mg RE/gFM.The antibacterial study showed that MIC of ethanol extract against Staphylococcus aureus was 20 mg/mL.After treated by Frucuts mume ethanol extract，the permeability of cell wall and membrane significantly increased，nucleic acid materials，Ca2+content and total leakage rate in the culture enhanced，and the cell metabolism of Staphylococcus aureus was disordered compared to the control.Consequently，the Frucuts mume ethanol extract showed the significant antibacterial effect against Staphylococcus aureus，suggesting its potential application as natural preservative in foods.

Fructusmume；Staphylococcusaureus；antibacterialeffect

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.008

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（13226602D）

周茜（1986—），女（漢），講師，博士，研究方向：活性物質(zhì)研究與食品安全。

趙文（1962—），女（漢），教授，碩士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)分析與食品安全。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

2015-09-29