唐桂明，叢巍巍，王 科，于雪艷，張華慶，呂 釗，桂泰江

（1.大連遼南船廠，遼寧大連 116041；2.海洋涂料國家重點實驗室，海洋化工研究院有限公司，山東青島 266071）

0 引言

海洋是生命的搖籃，給人類提供了豐富的資源和能源，與人類的生活早已密不可分。但在人類開發(fā)和利用海洋資源的過程中，海洋中的污損生物［1］給航運、海水養(yǎng)殖以及海洋工程等帶來巨大的安全隱患和經濟損失。它們的附著污損會加速船體及浸海設施的腐蝕［2］；增加船舶的航行阻力［3-4］；增大燃油消耗［5］；導致二氧化碳排放量增加和全球溫室效應加?。欢氯B(yǎng)殖網(wǎng)箱［6］以及冷卻水管道；使海洋儀器儀表失靈；影響艦艇航速以及聲納裝置的偵查性能［7］；削弱軍艦的戰(zhàn)斗力等。并且外來物種的入侵對海洋生態(tài)的破壞也是難以估量的，據(jù)世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）2014年報告中稱，世界上90%以上的生態(tài)系統(tǒng)都曾遭受過外來物種入侵，外來物種的入侵導致了全球20%脊椎動物的滅絕，每年給全球造成數(shù)千億美元的損失［8］。迄今為止，涂覆防污涂料仍然是眾多防止海洋生物附著的方法中最為經濟和有效的措施。

傳統(tǒng)防污涂料［9］通過砷、汞、鉛等重金屬的釋放，在涂層周圍產生毒性環(huán)境，對污損海生物進行趨避毒殺。其釋放的重金屬在海洋中難以降解，隨著生物鏈的傳遞，在海洋生物體內蓄積。在取得良好防污效果的同時，亦給海洋生態(tài)造成難以修復的創(chuàng)傷。為此，各國紛紛出臺相應的公約及環(huán)保法規(guī)以限制防污毒劑的使用，并要求對含防污劑的防污涂料進行海洋環(huán)境風險評估，提高了此類防污涂料的市場準入門檻?，F(xiàn)階段市場的主流技術產品——無錫自拋光防污涂料，以氧化亞銅［10］作為主防污劑，其含量高達30%～50%，據(jù)統(tǒng)計，每年約有幾百萬升以銅類防污劑為主的防污毒料釋放到海洋中，它們會在海洋，特別是海港中大量積聚，影響海生物呼吸并致其死亡，從而破壞生態(tài)環(huán)境。因此環(huán)境友好型防污劑的開發(fā)和使用凸顯其重要性。近年來，從天然產物［11］中提取次級代謝物等活性物質作為有毒防污劑的替代產品的探索一直沒有停止腳步。本研究以青島海域生物膜中分離純化的活性菌株作為受試菌株，考察其對藻類的抑制附著行為，為環(huán)境友好型防污劑的研發(fā)提供基礎指導。

1 試驗儀器及材料

1.1 試驗儀器

LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；GXZ-3100型光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；SIGMA離心機，德國；CASY快速細胞活力分析儀，德國Innovatis公司。

1.2 試劑

氯化鈉（NaCl），分析純，天津科密歐化學試劑開發(fā)中心；氯化鉀（KCl），分析純，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉（Na2HPO4），分析純，天津廣成化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4），分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗生物

海洋微藻中肋骨條藻（Skeletonema costatum）：硅藻門、中心綱、圓篩藻目、骨條藻科、骨條藻屬。中肋骨條藻是一種廣溫廣鹽的海洋浮游硅藻，它廣泛分布于世界各大洋的近海海域，對近岸海域初級生產力以及海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用［12］。中肋骨條藻是我國沿海近岸海域浮游植物常見優(yōu)勢種類［13］，其赤潮也頻繁發(fā)生。因此本研究將其作為試驗生物。

1.4 活性菌株

通過對防污涂料樣板表面生物膜進行分離純化，共獲得6種活性菌株，如表1所示。

表1 篩選活性菌株Table 1 Choice of active strains

2 CASY緩沖溶液的配制

分別稱取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、3.58 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶解于1 L蒸餾水中，待完全溶解后，采用0.22 μm醋酸纖維膜對緩沖溶液進行過濾，得到CASY緩沖溶液，并將其置于4～25℃下保存［14］。

3 試驗方法

3.1 f/2營養(yǎng)液的制備及上清液的獲得

先對試驗所用錐形瓶、容量瓶等玻璃儀器進行酸處理，再用蒸餾水將其沖洗干凈后，進行高壓滅菌（120℃，0.2 MPa，20 min）。試驗過程中所用海水經0.45 μm醋酸纖維膜過濾后，再進行高壓滅菌（120℃，0.2 MPa，20 min），待冷卻后，配制成f/2營養(yǎng)液。

將培養(yǎng)好的6種細菌發(fā)酵液分別裝入50 mL離心管中，于8 000 r/min轉速下離心20 min，離心靜置后收集上清液。

3.2 抑藻試驗［15］

將長勢良好的中肋骨條藻藻種接種到5 L玻璃容器中，容器中含有4 L f/2營養(yǎng)液海水，置于光照培養(yǎng)箱中進行擴大化培養(yǎng)，其中培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光照強度為4 000 Lx，明暗周期為12 h∶12 h。在藻細胞處于指數(shù)生長期時，將藻液以相同體積（100 mL）轉移到已經滅菌處理過的250 mL錐形瓶中，將6種細菌發(fā)酵液及離心得到的上清液按不同體積加入到上述藻液中，達到各設置的梯度濃度，見表2，每個梯度濃度設置3個平行樣。搖勻后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時取樣，用CASY快速細胞活力分析儀測定藻種的密度。

表2 抑藻試驗發(fā)酵液梯度濃度設置Table 2 The determined concentration of fermentation broth for algae inhibition test

4 試驗結果

試驗過程中分別制備了6種細菌發(fā)酵液以及上清液，考察其對中肋骨條藻的生長抑制作用，結果見圖1。由圖1可見，Exiguobacterium indicum發(fā)酵液（圖1a）濃度低于3%時，對中肋骨條藻生長產生促進作用；濃度為4%時，前90 h處于促進藻生長狀態(tài)，90 h時達到最大值后開始抑制生長；濃度為5%時，始終處于抑制中肋骨條藻生長的狀態(tài)。Exiguobacterium indicum上清液（圖1b）在濃度為2%的前70 h內，對中肋骨條藻生長的促進以及抑制作用不是很明顯，但在70 h之后，對其生長產生明顯的抑制作用；而濃度高于2%時，均處于抑制藻類生長的狀態(tài)。

圖1 6種細菌發(fā)酵液及上清液對中肋骨條藻的生長抑制作用Figure 1 Inhibition to Skeletonema costatum of the fermentation broth and supernatants of six active strains

Exiguobacterium acetylicum發(fā)酵液（圖1c）濃度低于3%時，促進中肋骨條藻的生長；濃度為4%且35 h內抑制中肋骨條藻的生長，之后又促進了藻的生長；而濃度高于5%時抑制藻的生長；Exiguobacterium acetylicum上清液（圖1d）在濃度2%時的前50 h促進藻生長到最大值后開始抑制藻生長；濃度高于2%時均處于抑制中肋骨條藻生長階段。

Bacillus cereus發(fā)酵液（圖1e）在濃度低于2%時，促進中肋骨條藻生長；濃度為3%和4%時，開始促進藻生長到最大值后開始抑制藻生長；濃度高于5%時，抑制藻生長；Bacillus cereus上清液（圖1f）濃度為2%時，開始促進藻生長之后抑制其生長；濃度高于3%時，抑制藻生長。

Pseudoalteromonas發(fā)酵液（圖1g）濃度低于2%時，促進中肋骨條藻的生長；濃度為3%和4%時，開始促進藻生長之后抑制藻生長；濃度高于5%時，抑制藻生長。Pseudoalteromonas上清液（圖1h）濃度在2%時，先促進藻生長到最大值后抑制藻生長；濃度高于3%時，始終處于抑制藻生長的狀態(tài)。

Kytococcus sedentarius發(fā)酵液（圖1i）濃度在2%時，促進中肋骨條藻生長；濃度為3%～4%時先促進生長再抑制生長；濃度高于5%時，抑制藻生長。Kytococcus sedentarius上清液（圖1j）濃度在2%時，先促進生長后抑制生長；濃度高于3%時，抑制藻生長。

Aureobasidium pullulans HN發(fā)酵液（圖1k）濃度為0.5%時，促進中肋骨條藻生長；當其濃度高于1%時，抑制藻生長；Aureobasidium pullulans HN上清液（圖1l）濃度低于0.5%時，促進藻生長；當濃度高于1%時，抑制藻生長。

對試驗結果計算EC50值，結果如表3所示。由表3可見，活性菌株發(fā)酵液對中肋骨條藻的抑制作用要稍弱于其上清液，6種細菌對中肋骨條藻表現(xiàn)出的抑制作用大小為：Aureobasidium pullulans HN最強；其次為Bacillus cereus和Pseudoalteromonas；而Kytococcus sedentarius、Exiguobacterium indicum和Exiguobacterium acetylicum抑制作用相差不大。由表3還可知，微生物發(fā)酵液的毒性物質主要存在于離心后的上清液中。

5 結語

采用防污漆樣板表面獲得的6種活性菌株的發(fā)酵液及上清液對中肋骨條藻進行藻類生長影響的試驗研究。研究結果表明，活性菌株上清液對中肋骨條藻有更好的抑制作用，其抑制作用大小為：Aureobasidium pullulans HN最強；其次為Bacillus cereus和Pseudoalteromonas；而Exiguobacterium indicum、Exiguobacterium acetylicum和Kytococcus sedentarius的抑制作用相差不大，且發(fā)酵液對藻類生長的影響結果與上清液類似。微生物發(fā)酵液的活性抑藻物質更多地存在于離心后的上清液中。由于活性抑藻物質來源于海洋活性菌株，從而為環(huán)境友好型防污劑的獲得提供了理論基礎。

1 王珊珊，張瑞標，劉振華，等.海洋污損生物附著及防除途徑［J］.河北漁業(yè)，2016（11）：42-45.

2 鄭紀勇.海洋生物污損與材料腐蝕［J］.中國腐蝕與防護學報，2010（2）：171-176.

3 張璇.船舶仿生防污溝槽表面減阻性能數(shù)值模擬分析［D］.湖北武漢：武漢理工大學，2014.

4 Michael P Schultz. Frictional Resistance of Antifouling Coating Systems［J］. J Fluids Eng.，2005，126（6）：1 039-1 047.

5 柏芳，王澤華，王國偉，等.防海生物污損材料研究現(xiàn)狀［J］.腐蝕與防護，2014（5）：420-424.

6 嚴濤，劉姍姍，曹文浩.中國沿海水產設施污損生物特點及防除途徑［J］.海洋通報，2008，27（1）：102-110.

7 張濤，彭飛，閔少松.海洋污損對螺旋槳葉切面性能影響的數(shù)值模擬［J］.中國艦船研究，2016，11（3）：32-36.

8 梁琳.最具威脅性物種半數(shù)進入中國［J］.生態(tài)經濟，2015，31（9）：10-13.

9 戴宇均，汪鵬程，孫巨福.船舶防污涂料的研究進展［J］.安徽化工，2013，39（5）：10-12.

10 張金偉，鄭紀勇，王利，等.仿生防污材料的研究進展［J］.中國材料進展，2014，33（2）：86-94.

11 叢巍巍，肖玲，王科，等.天然防污劑的研究現(xiàn)狀［J］.材料導報，2012，26（1）：334-336.

12 Rijstenbil J W. Phytoplankton Composition of Stagnant and Tidal Ecosystems in Relation to Salinity，Nutrients，Light and Turbulence［J］. Netherlands Journal of Sea Research，1987，21（2）：113-123.

13 王朝暉，袁美玲，駱育敏，等.海洋卡盾藻與中肋骨條藻和錐狀斯氏藻種間競爭研究［J］.水生生物學報，2010，34（2）：336-34.

14 高敏.海洋微生物和微藻中防污活性物質的提取及其性能研究［D］.山東青島：中國海洋大學，2014.

15 別聰聰，李鋒民，李媛媛，等.六種大型藻浸提液對中肋骨條藻的抑制及活性成分分離［J］.中國海洋大學學報（自然科學版），2011，41（7/8）：107-112.